周旭波,陳瑜琦,丁鼎,劉帥,王健

(江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司,江蘇 無(wú)錫,214000)

L-色氨酸是人和動(dòng)物體內(nèi)的一種必需氨基酸,是構(gòu)成蛋白的重要組成部分,但人和動(dòng)物自身不能合成L-色氨酸,必須從外界攝取[1]。色氨酸是生物體內(nèi)合成5-羥色胺、褪黑素和犬尿氨酸等生理活性物質(zhì)的前體,在生物體特定的生命活動(dòng)中扮演重要角色[2-3]。在醫(yī)學(xué)上,L-色氨酸是復(fù)合氨基酸制劑和氨基酸注射液的重要原料,用于改善患者蛋白質(zhì)攝入不足、氨基酸吸收障礙等問題,以及改善手術(shù)后病人的營(yíng)養(yǎng)狀況。近年來(lái)的研究表明,色氨酸及其代謝物在許多人體疾病調(diào)控中發(fā)揮了不同的生物學(xué)效應(yīng),如部分腫瘤疾病、炎癥、肝腎疾病、糖尿病、免疫系統(tǒng)疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[4-8]。在食品和飼料添加劑領(lǐng)域,色氨酸可用來(lái)強(qiáng)化食品和做飼料添加劑,對(duì)補(bǔ)充食物和飼料中的營(yíng)養(yǎng)、提高蛋白質(zhì)的利用率具有重要的作用。

目前L-色氨酸的生產(chǎn)方法以微生物發(fā)酵法為主[9],相比傳統(tǒng)的化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法,微生物發(fā)酵法具有更低的生產(chǎn)成本、更加綠色環(huán)保、更易于大規(guī)模生產(chǎn)等顯著的優(yōu)越性[10]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的過(guò)程中,微生物菌種的優(yōu)劣決定著發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)成本甚至產(chǎn)品質(zhì)量,因此,選育高產(chǎn)色氨酸優(yōu)良菌株具有重要意義。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術(shù)最近幾年在科研及工業(yè)領(lǐng)域逐步得到應(yīng)用,尤其在微生物突變育種中取得了良好的效果[11-13]。與其他誘變育種技術(shù)相比,ARTP誘變育種技術(shù)能夠更有效造成DNA的突變,并且設(shè)備操作簡(jiǎn)單快捷,對(duì)環(huán)境條件要求較低,操作過(guò)程中安全性較高,在高效進(jìn)化育種領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力[14]。

本研究使用ARTP誘變育種技術(shù)并結(jié)合結(jié)構(gòu)類似物抗性定向篩選,對(duì)色氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行多次誘變處理和篩選,獲得色氨酸高產(chǎn)突變株,為L(zhǎng)-色氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

色氨酸生產(chǎn)菌AC-1042(Escherichiacoli),江蘇澳創(chuàng)生物科技有限公司保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,蛋白胨10,酵母浸出粉5,NaCl 5,瓊脂20,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

抗性培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基中加入一定量的結(jié)構(gòu)類似物。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖 30 g/L,(NH4)2SO42 g/L,K2HPO4·3H2O 5 g/L,KH2PO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 1.2 g/L,酵母粉5 g/L,檸檬酸 1.2 g/L,FeSO4·7H2O 5.6 mg/L,MnSO4·H2O 2 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,(NH4)2SO45 g/L,KH2PO47.5 g/L,MgSO4·7H2O 2.4 g/L,酵母粉1 g/L,檸檬酸 2 g/L,FeSO4·7H2O 75 mg/L,MnSO4·H2O 2 mg/L,ZnSO4·H2O 2.4 mg/L,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器

ARTP-II型ARTP誘變系統(tǒng),無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；YXJ-2高速離心機(jī),常州國(guó)華電氣有限公司；30 L自動(dòng)發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司；SBA-40C生物傳感分析儀,山東科學(xué)院生物研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斜面活化培養(yǎng)

在無(wú)菌環(huán)境下打開保藏菌種劃線接種于活化斜面上,置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

1.2.2 菌懸液的制備

從新鮮活化斜面菌落上挑取1環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中,置于搖床中培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min、搖床溫度36.5 ℃,培養(yǎng)4.5 h后,取1 mL種子液于1.5 mL 無(wú)菌離心(Eppendorf,EP)管中,4 000 r/min離心,去除上清液,加入1 mL無(wú)菌生理鹽水,混勻,離心,反復(fù)3次,將菌懸液稀釋,使菌懸液OD600值為0.6～1.0。

1.2.3 ARTP誘變致死率的測(cè)定

取10 μL 稀釋菌液置于無(wú)菌不銹鋼載片上涂抹均勻,將載片置于ARTP誘變系統(tǒng)中誘變處理。ARTP 誘變條件：射頻功率120 W,處理距離2 mm,載氣流量10 標(biāo)準(zhǔn)升每分鐘(standard liters per minute,SLM),處理溫度為室溫(20～40 ℃),處理時(shí)間0、10、20、30、40、50、60、70和80 s。將處理過(guò)的載片放入裝有1 mL 無(wú)菌生理鹽水的EP管中,振蕩混勻,然后稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4,各取100 μL均勻涂布到平板上,每個(gè)梯度做3個(gè)平行,36 ℃培養(yǎng)20 h后菌落計(jì)數(shù),致死率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 ARTP誘變處理

取10 μL 稀釋菌液置于無(wú)菌不銹鋼載片上涂抹均勻,將載片置于ARTP誘變系統(tǒng)中誘變處理,ARTP 誘變條件同1.2.3,誘變處理時(shí)間選擇致死率達(dá)到90%以上的處理時(shí)間。將處理過(guò)的載片放入裝有1 mL 無(wú)菌生理鹽水的EP管中,振蕩混勻,然后稀釋到10-1、10-2,各取100 μL均勻涂布到平板上,每個(gè)梯度做3個(gè)平行,36 ℃培養(yǎng)20 h。

1.2.5 抗性篩選

制備不同濃度梯度的5-甲基色氨酸(5-methyltryptophan,5-MT)、對(duì)氟苯丙氨酸(phenylalanine,PFP)抗性培養(yǎng)基平板[15]。用接種環(huán)從誘變處理后培養(yǎng)的平板中取一滿環(huán)菌裝入無(wú)菌EP管中,使用無(wú)菌水離心洗滌2次,然后使用無(wú)菌水制成菌懸液,直接將菌懸液分別涂布于抗性平板上,36 ℃培養(yǎng)2～3 d。

1.2.6 菌種初篩

將種子培養(yǎng)基分裝到96孔板中,每孔0.1 mL,將平板上的單菌落挑到種子液孔板中,180 r/min,36 ℃ 培養(yǎng)6 h,并同時(shí)接種到另一塊平板上,36 ℃培養(yǎng)22 h后放入冰箱。將發(fā)酵培養(yǎng)基分裝到孔板中,每孔0.09 mL,種子液接0.015 mL,180 r/min,36.5 ℃培養(yǎng)20 h。挑取發(fā)酵產(chǎn)酸較高的菌種,將平板上對(duì)應(yīng)序號(hào)的菌種挑至斜面,36.5 ℃培養(yǎng)20 h,甘油管保存。

1.2.7 菌種復(fù)篩

將初篩甘油管保藏的菌種分別劃一支斜面,36 ℃培養(yǎng)20 h。從斜面上挑1環(huán)菌至500 mL種子搖瓶中,180 r/min,36.5 ℃培養(yǎng)5.5 h,轉(zhuǎn)接500 mL發(fā)酵搖瓶,180 r/min,36.5 ℃培養(yǎng)22 h,測(cè)發(fā)酵搖瓶產(chǎn)酸,挑取產(chǎn)酸較高的菌種保藏。

1.2.8 30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)驗(yàn)證

將保藏的菌種劃線接種于活化斜面上,36 ℃培養(yǎng)20 h。從活化斜面上挑取2環(huán)接入裝液量30 mL的500 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中,置于200 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上36.5 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為12～14。將培養(yǎng)結(jié)束的搖瓶種子按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。初始通氣量10 L/min,初始攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min,通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制pH在7.0左右,培養(yǎng)溫度36.5 ℃。培養(yǎng)過(guò)程中,當(dāng)溶氧降低至30%時(shí)交替提高轉(zhuǎn)速和通氣量,維持溶氧在30%～40%。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度降至10 g/L時(shí),開始流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為700 g/L的葡萄糖溶液。

1.2.9 分析檢測(cè)方法

1.2.9.1 菌體生長(zhǎng)測(cè)定

菌液用蒸餾水稀釋后,測(cè)定600 nm下的OD600值。

1.2.9.2 葡萄糖質(zhì)量濃度測(cè)定

使用生物傳感分析儀測(cè)定。

1.2.9.3 色氨酸含量測(cè)定

采用分光光度法[16]和液相色譜法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP致死曲線

ARTP誘變對(duì)色氨酸生產(chǎn)菌的致死率與一定條件下對(duì)其處理時(shí)間有很大關(guān)系。為了獲得最佳的誘變條件,按照1.2.3的方法對(duì)出發(fā)菌進(jìn)行誘變處理并計(jì)算致死率,結(jié)果見圖1。隨著ARTP誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng),菌株的致死率逐漸上升,當(dāng)處理時(shí)間為40 s時(shí)致死率為91.79%,處理時(shí)間為60 s時(shí)致死率為99.99%,70 s之后致死率達(dá)到100%。為對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行有效誘變,需要有較高的致死率,本文選擇將致死率控制在90%以上的誘變處理時(shí)間,即選擇ARTP誘變時(shí)間為40 s。

圖1 不同ARTP誘變處理時(shí)間下色氨酸菌株的致死率曲線Fig.1 Lethality of L-tryptophan strains with different ARTP mutagenic treatment time

2.2 5-MT抗性菌株的篩選

5-MT是L-色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物,選育具有5-MT抗性的突變株可以減少或解除L-色氨酸對(duì)合成途徑中酶的反饋抑制和阻遏,有利于提高菌株產(chǎn)L-色氨酸的能力[18]。以色氨酸生產(chǎn)菌AC-1042為出發(fā)菌株,經(jīng)ARTP誘變處理后,選育5-MT的抗性菌株。首先要確定色氨酸生產(chǎn)菌株對(duì)5-MT耐受的臨界濃度,將色氨酸生產(chǎn)菌的懸液涂布于5-MT梯度濃度平板上培養(yǎng),生長(zhǎng)情況如表1。

表1 5-MT臨界濃度的確定Table 1 Critical concentration of 5-MT resistance

由表1可知色氨酸生產(chǎn)菌對(duì)5-MT的臨界質(zhì)量濃度為1 mg/mL。按照1.2.4的方法對(duì)色氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行誘變處理,從誘變處理后涂布的平板上挑出生長(zhǎng)良好的菌落,制成菌懸液分別涂布到含有1、1.5、2 mg/mL 5-MT的平板上,36 ℃培養(yǎng)3 d。從平板上挑選生長(zhǎng)良好的菌落115株,分別轉(zhuǎn)接斜面,命名為ACT001～ACT115。按照1.2.6和1.2.7的方法對(duì)得到的突變株進(jìn)行篩選,篩選出色氨酸產(chǎn)量較高的5株菌株,結(jié)果如表2。

表2 突變株篩選結(jié)果Table 2 Results of the mutant strain screening

將表2中的5株菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),轉(zhuǎn)接斜面?zhèn)髦恋?0代,取第10代菌株做搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸驗(yàn)證,與初代突變株產(chǎn)酸結(jié)果進(jìn)行對(duì)照,試驗(yàn)結(jié)果見圖2。經(jīng)過(guò)傳代試驗(yàn),菌株ACT106產(chǎn)酸最高,并且能夠穩(wěn)定產(chǎn)酸,選擇菌株ACT106做下一步誘變處理出發(fā)菌。

圖2 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定Fig.2 Determination of genetic stability

2.3 PFP抗性菌株的篩選

在色氨酸的生物合成途徑中,3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(3-deoxy-2-arabina-heptanose-7-phosphate,DAHP)反應(yīng)是第1個(gè)限速步驟,DAHP合成酶受L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的協(xié)同反饋抑制,第1個(gè)分支點(diǎn)處的分支酸變位酶受L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的部分抑制[19]。因此,選育L-苯丙氨酸、L-酪氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的突變株可以從遺傳上減弱或解除這些反饋抑制作用,增強(qiáng)色氨酸合成途徑的代謝流,提高色氨酸的產(chǎn)出[20]。以菌株ACT106為出發(fā)菌株,經(jīng)ARTP誘變處理后,選育具有PFP抗性的突變菌株。首先確定色氨酸生產(chǎn)菌株對(duì)PFP耐受的臨界質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。按照方法1.2.4對(duì)菌株ACT106進(jìn)行誘變處理,從誘變處理后涂布的平板上挑出生長(zhǎng)良好的菌落,制成菌懸液分別涂布到含有0.5、1、1.5 mg/mL PFP的平板上,36 ℃培養(yǎng)3 d。最終從平板上篩選到生長(zhǎng)良好的菌落109株,分別轉(zhuǎn)接斜面,命名為ACTR001～ACTR109。按照1.2.6和1.2.7的方法對(duì)得到的突變株進(jìn)行篩選,選出產(chǎn)量較高的5株菌株,搖瓶復(fù)篩后各菌株的產(chǎn)酸結(jié)果如表3所示。

表3 突變株篩選結(jié)果Table 3 Results of the mutant strain screening

將表3中的5株菌株進(jìn)行傳代,考察菌株的遺傳穩(wěn)定性,傳至第10代時(shí),取第10代菌株做搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸驗(yàn)證,與初代突變株產(chǎn)酸進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果見圖3。經(jīng)過(guò)傳代試驗(yàn),菌株ACTR103產(chǎn)酸最高,并且能夠穩(wěn)定產(chǎn)酸,選擇菌株ACTR103做下一步誘變處理出發(fā)菌。

圖3 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定Fig.3 Determination of genetic stability

2.4 多次ARTP誘變處理+抗性篩選

將上述誘變篩選出菌株ACTR103按照1.2.4和1.2.5進(jìn)行多次誘變處理和抗性篩選,使菌株對(duì)5-MT和PFP的抗性分別提高至5和3 mg/mL。經(jīng)過(guò)篩選,選出產(chǎn)量較高的5株菌株,結(jié)果如表4。將表4中的5株菌株進(jìn)行傳代考察菌株的遺傳穩(wěn)定性,傳至第10代時(shí),取第10代菌株做搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸驗(yàn)證,與初代突變株產(chǎn)酸進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果見圖4。經(jīng)過(guò)傳代復(fù)篩后上述5株菌株均能穩(wěn)定產(chǎn)酸,其中菌株ACTRP104搖瓶發(fā)酵后的L-色氨酸質(zhì)量濃度為4.591 g/L,比原始菌株AC-1042搖瓶發(fā)酵后的L-色氨酸質(zhì)量濃度(3.570 g/L)提高了28.6%。

表4 突變株篩選結(jié)果Table 4 Results of the mutant strain screening

圖4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定Fig.4 Determination of genetic stability

2.5 30 L發(fā)酵罐培養(yǎng)驗(yàn)證

為考察突變株ACTRP104發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的性能,使用30 L發(fā)酵罐按照1.2.8的方法進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),同時(shí)以菌株AC-1042做對(duì)照。結(jié)果如圖5所示。

a-突變株ACTRP104；b-出發(fā)菌AC-1042圖5 突變株ACTRP104與出發(fā)菌AC-1042發(fā)酵過(guò)程比較Fig.5 Comparision of fermentation process between mutant ACTRP104 and AC-1042

在發(fā)酵過(guò)程中,突變株ACTRP104菌體增長(zhǎng)的OD600值和殘?zhí)菨舛认啾瘸霭l(fā)菌AC-1042差別不大,但是色氨酸濃度從8 h后突變株ACTRP104明顯高于出發(fā)菌AC-1042。從30 L罐發(fā)酵的結(jié)果來(lái)看,出發(fā)菌AC-1042發(fā)酵結(jié)束時(shí),色氨酸質(zhì)量濃度為51.08 g/L,而突變株ACTRP104發(fā)酵結(jié)束時(shí),色氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到61.65 g/L,相比出發(fā)菌AC-1042提高了20.69%。經(jīng)過(guò)計(jì)算,突變株ACTRP104發(fā)酵結(jié)束葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.64%,比出發(fā)菌AC-1042的葡萄糖轉(zhuǎn)化率(17.52%)提高了17.81%；同時(shí),突變株ACTRP104的發(fā)酵周期也比出發(fā)菌AC-1042縮短了4 h。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)使用ARTP誘變育種技術(shù)結(jié)合結(jié)構(gòu)類似物抗性定向篩選技術(shù),進(jìn)行高產(chǎn)色氨酸菌株的選育。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)ARTP誘變處理后更易于在結(jié)構(gòu)類似物抗性的篩選平板上獲得抗性突變株。ARTP誘變育種技術(shù)與結(jié)構(gòu)類似物抗性定向篩選相結(jié)合的策略,可以高效地選育色氨酸高產(chǎn)菌株。ARTP誘變處理色氨酸生產(chǎn)菌株的處理時(shí)間選擇40 s,致死率達(dá)到90%以上,使用分別含有5-MT、PFP的抗性培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選,篩選解除或減弱L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸反饋抑制的突變株。經(jīng)過(guò)多次ARTP處理和抗性篩選,并經(jīng)過(guò)遺傳穩(wěn)定性測(cè)定,最終獲得1株高產(chǎn)色氨酸的突變株ACTRP104,經(jīng)過(guò)30 L發(fā)酵罐培養(yǎng),色氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到61.65 g/L,對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到20.64%,相比于出發(fā)菌AC-1042分別提高了20.69%和17.81%,同時(shí)發(fā)酵周期縮短了4 h。研究結(jié)果證明,本研究采用的ARTP誘變育種技術(shù)與結(jié)構(gòu)類似物抗性定向篩選相結(jié)合的策略選育色氨酸高產(chǎn)菌株取得了良好的效果,可以進(jìn)一步持續(xù)對(duì)色氨酸生產(chǎn)菌進(jìn)行選育改良。色氨酸突變株ACTRP104發(fā)酵技術(shù)水平有了較大提升,菌種穩(wěn)定性良好,應(yīng)用于色氨酸工業(yè)化生產(chǎn),可以顯著提高色氨酸發(fā)酵的產(chǎn)酸率和轉(zhuǎn)化率,降低發(fā)酵生產(chǎn)成本,具有較好的工業(yè)化推廣與應(yīng)用潛力。