張獻(xiàn),馮治平,2,張耀,張雪怡,楊麗娟,2*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000) 2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室(四川輕化工大學(xué)),四川 宜賓,644000)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC),是發(fā)酵食品和酒精飲料在生產(chǎn)、儲藏過程中生成的對人體具有潛在致癌性和遺傳毒性的一種微量有害物質(zhì)[1-3]。2007年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其歸為2A類致癌物后,EC問題引起世界各國的關(guān)注[4]。為保障食品安全,消除發(fā)酵食品和酒類中的EC刻不容緩。

目前針對由尿素產(chǎn)生酒精飲料EC問題,國內(nèi)外主要涉及以下4個研究領(lǐng)域：對發(fā)酵工藝的優(yōu)化[5-6]、物理吸附[7-8]、代謝工程改造酵母[9-10]以及生物酶法(如脲酶[11-13]),其中生物酶法是目前最理想的一種方法[14]。脲酶能夠消除EC前體物質(zhì)尿素,從而從源頭上控制EC的產(chǎn)生[15],而氨基甲酸乙酯水解酶(urethanase,UH)能將已生成的EC降解成乙醇、氨和二氧化碳[16]。最早報道的UH是KOBASHI等[17]從Citrobactersp.分離得到的,隨后又在Bacilluslicheniformis和B.thiaminolyticus發(fā)現(xiàn)了UH的活性[18-19]。2006年,AKUTSU-SHIGENO等[20]發(fā)現(xiàn)來自RhodococcusequiTB-60的55 kDa蛋白具有UH活性,獲得其基因序列(GenBank:DD320008.1),并實現(xiàn)了異源表達(dá)。隨后,李京京等[21]從小鼠腸道中篩選出了一株能降解EC的LysinibacillusfusiformisSC02并通過N端測序獲得了其編碼UH的基因序列(GenBank:KU353448.1),研究發(fā)現(xiàn)該酶為中性酶,且穩(wěn)定性較差。2019年,MASAKI等[22]在Candidaparapsilosis中獲得了該菌編碼的UH基因序列(GenBank:LC511748.1),研究發(fā)現(xiàn)該菌的UH由4個大小為60 kDa的亞基組成。

本研究通過對假絲酵母的UH進(jìn)行亞克隆并實現(xiàn)異源可溶性表達(dá),研究了其酶學(xué)性質(zhì),研究結(jié)果可為后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析、分子改造及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

假絲酵母(菌株保藏號：CCTCC AY 2017001),中國典型培養(yǎng)物保藏中心；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)、pET-28a,本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.2；配制固體培養(yǎng)基需加入20的瓊脂。

1.1.3 主要試劑

DNA及蛋白質(zhì)Markar,北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母基因提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；DNA膠回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ,寶生物工程(大連)有限公司；蛋白胨、NaCl、酵母粉、氨基甲酸乙酯等常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

UV-1800分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-Ⅱ D超聲波破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；5340R高速冷凍離心機(jī),德國Eppendorf儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1cpUH基因克隆與pET-28a-cpUH的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的假絲酵母氨基甲酸乙酯水解酶(LC511748.1)基因序列設(shè)計特異性引物。

以假絲酵母基因組為模板,PCR擴(kuò)增cpUH基因。PCR程序測定：94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸10 min,其中變性、退火及延伸循環(huán)30次。純化PCR產(chǎn)物,連接到pET-28a上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cpUH,并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,通過雙酶切鑒定重組子,陽性質(zhì)粒送擎科生物公司測序。

1.2.2 重組cpUH的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-28a-cpUH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3)中,過夜培養(yǎng)并活化E.coliBL21/pET-28a-cpUH。以2%的接種量,將培養(yǎng)好的E.coliBL21/pET-28a-cpUH種子液接到新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kana)。37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h,檢測菌液OD600。在對數(shù)期(OD600為0.6～0.8)時,加入0.25 mmol/L IPTG,于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。

1.2.3 親和色譜純化cpUH蛋白

在4 ℃、7 000 r/min下收集培養(yǎng)好的重組菌E.coliBL21/pET-28a-cpUH菌液。用20 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗滌菌體2 次后,重懸菌體并置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎。將破碎后的菌液于4 ℃、7 000 r/min條件下離心30 min,收集上清液(即cpUH粗酶液)。純化前先用鎳柱平衡緩沖液(含250 mmol/L NaCl,5 mmol/L 咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液)進(jìn)行鎳柱的平衡,然后使用洗脫緩沖液(含有10～250 mmol/L的咪唑)進(jìn)行梯度洗脫,最后使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。

1.2.4 酶活力測定方法

1.2.4.1 酶活力測定步驟

(1)

式中：ΔOD625,測定反應(yīng)后與空白樣品吸光度之差；n,酶活力測定液稀釋倍數(shù)；k,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；15,酶作用的時間,min。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.5 cpUH的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.5.1 酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

將經(jīng)鎳柱純化得到的酶液與底物EC分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃的溫度下反應(yīng),以相對酶活力確定該酶的最適反應(yīng)溫度。將鎳柱純化后的酶液在上述不同溫度條件下保溫8 h,中間每隔2 h測定1次酶活力,以該酶在各溫度的初始酶活力為100%,計算該酶的相對酶活力。

1.2.5.2 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

將純化后的酶液與底物EC在不同pH(3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10)的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后測定cpUH在不同pH條件下的酶活力,確定該酶的最適反應(yīng)pH。將純化后的酶液保存在不同pH(5、6、7、8、9)緩沖液中,在4 ℃冰箱中放置8 h,每隔2 h檢測1次酶活力,以各pH的初始酶活力為100%,計算各時間段所對應(yīng)的相對酶活力。

1.2.5.3 酶對NaCl 和乙醇的耐受性檢測

配制不同NaCl濃度的緩沖液,將鎳柱純化得到的酶液保存于各緩沖液中,4 ℃保存2 h,測定相應(yīng)條件下的酶活力。計算該酶在不同NaCl濃度條件下的酶活力,其中以NaCl濃度為0時所測酶活力為100%,確定NaCl濃度對其酶活力穩(wěn)定性的影響。配制含有不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇緩沖液,將純化得到的酶液保存于各緩沖液中,4 ℃保存4 h,測定相應(yīng)條件下的酶活力。計算該酶在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下所對應(yīng)的酶活力,并以乙醇體積分?jǐn)?shù)為0時所測酶活力為100%,確定乙醇體積分?jǐn)?shù)對酶活力穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.4 金屬離子、EDTA對酶活力的影響

將純化得到的酶液與終濃度為1 mmol/L 的金屬離子(Fe3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Cu2+)或EDTA的緩沖液混合,4 ℃保存30 min,測定酶活力。確定金屬離子及EDTA對酶活力的影響。

1.2.5.5 酶的底物特異性檢測

在最適溫度和最適pH條件下,將純化得到的酶液分別與質(zhì)量濃度為30 g/L氨基甲酸甲酯、EC、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺反應(yīng),測定相應(yīng)酶活力,以酶對EC的酶活力為100%。

1.2.5.6 動力學(xué)參數(shù)的確定

測定cpUH在不同EC濃度體系(5、10、20、80、200、500 mmol/L)中的反應(yīng)速度,根據(jù)底物濃度與反應(yīng)初速度之間的關(guān)系,利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法確定動力學(xué)參數(shù)Km與Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpUH基因的克隆與表達(dá)

以假絲酵母基因組為模板,PCR擴(kuò)增cpUH基因,約在1 650 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1-a)。PCR產(chǎn)物連入pET-28a載體,經(jīng)雙酶切釋放約1 650 bp的目的條帶(圖1-b),測序結(jié)果與GenBank公布序列一致,cpUH開放閱讀框為1 656 bp,編碼551個氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為61.65 kDa。

a-cpUH PCR產(chǎn)物；b-重組子(pET-28a-cpUH)酶切鑒定圖1 假絲酵母cpUH的基因克隆與酶切鑒定Fig.1 Gene cloning and enzyme digestion identification of C.parapsilosis cpUH

pET-28a-cpUH轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),經(jīng)0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE電泳檢測,在約60 kDa位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。

Marker-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記； 1-含有質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌的超聲上清液； 2-IPTG誘導(dǎo)的攜帶質(zhì)粒pET-28a-cpUH的大腸桿菌粗蛋白； 3-IPTG誘導(dǎo)含有質(zhì)粒pET-28a-cpUH的大腸桿菌超聲上清液圖2 重組cpUH誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of induced expression of recombinant cpUH

2.2 親和色譜分離純化重組cpUH

粗酶液經(jīng)過Ni2+-NTA親和色譜分離純化獲得電泳級cpUH,SDS-PAGE電泳檢測(圖3),約為60 kDa。經(jīng)過純化后,酶比活力為3.10 U/mg,純化倍數(shù)約為28.58倍(表1)。

2.3 酶反應(yīng)的最適溫度及其穩(wěn)定性

酶的最適反應(yīng)溫度如圖4-a所示,cpUH在溫度為25～60 ℃內(nèi),隨著溫度的上升,其酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。溫度為40 ℃時,酶活力達(dá)到最高；溫度>45 ℃時,酶活力急劇下降。

Marker-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記； 1-IPTG誘導(dǎo)的攜帶質(zhì)粒pET-28a-cpUH 的大腸桿菌粗蛋白； 2-通過Ni2+-NTA親和層析純化后的蛋白質(zhì)圖3 重組cpUH親和純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of affinity purification of recombinant cpUH

表1 Ni-NTA親和色譜純化重組cpUHTable 1 Purification of recombinant cpUH by Ni2+-NTA affinity chromatography

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖4 反應(yīng)溫度對cpUH的活力及穩(wěn)定性影響Fig.4 Effect of reaction temperature on activity and stability of cpUH

cpUH在25～30 ℃能保持很好的穩(wěn)定性,如圖4-b所示,8 h后仍有70%以上的酶活力。35 ℃表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,保溫8 h后仍保留48.08%的酶活力。但當(dāng)溫度>40 ℃后,cpUH的穩(wěn)定性較差,8 h后都失去了活力。

2.4 酶反應(yīng)的最適pH及其穩(wěn)定性

酶的最適反應(yīng)pH值如圖5-a所示。pH 3～4時,酶活力為0；pH 5.0～7.5時,隨著pH的升高,酶活力逐漸升高;pH=7.5時,酶活力達(dá)到最高,相對酶活力為100%；當(dāng)pH>7.5時,酶活力下降;但pH=8.5時還保留90%左右的酶活力；當(dāng)pH>8.5后,酶活力急劇下降;pH=10時,只保留了6%的酶活力。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖5 pH對cpUH的活力及穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of pH on activity and stability of cpUH

酶的pH穩(wěn)定性是酶在實際應(yīng)用中的一個重要指標(biāo)。由圖5-b可知,cpUH在pH 6.0～9.0都具有較好的穩(wěn)定性,8 h以后仍能保持70%左右的酶活力,而cpUH在pH 5.0中穩(wěn)定性較差,8 h后降到了0,失去酶活力。

2.5 酶對NaCl 和乙醇的耐受性

cpUH對NaCl和乙醇的耐受性分別如圖6所示。該酶的酶活力隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,都呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時,酶活力保留了50%左右,而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時,該酶的殘余酶活力為未經(jīng)NaCl處理酶活力的10%左右。乙醇的添加也抑制了cpUH的活性,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時,酶活力保持了60%左右,乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時,殘余酶活力為50%。該結(jié)果表明,cpUH對低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl 和低體積分?jǐn)?shù)乙醇具有一定耐受性,可為在醬油和低酒精度的黃酒中使用提供參考。

a-NaCl耐受性；b-乙醇耐受性圖6 cpUH對NaCl和乙醇的耐受性Fig.6 Tolerance of cpUH to NaCl and ethanol

2.6 金屬離子與EDTA對酶活力的影響

各種金屬離子對cpUH酶活力均有不同程度的抑制,其中Fe3+、Mn2+、Ca2+和Mg2+抑制了15%～20%的酶活力,Co2+抑制了41%的酶活力,而Zn2+、Cu2+嚴(yán)重抑制酶活力,酶活力分別降至原來的11%和0.77%；金屬螯合劑EDTA對酶活力無顯著影響,如圖7所示。

圖7 金屬離子與EDTA 對cpUH酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions and EDTA on the activity of cpUH

2.7 酶的底物特異性

為了考察cpUH對底物的特異性,本研究選擇6種底物進(jìn)行研究,結(jié)果如表2所示,測定了對3種氨基甲酸酯的酶活性。該酶對EC的活性最高,對氨基甲酸甲酯的活性為90.06%,對氨基甲酸正丁酯的活性為13.74%。相互比較了對3種酰胺化合物的酰胺酶活性。該酶對苯甲酰胺、L-谷氨酰胺和乙酰胺顯示出幾乎相同的活性。

表2 cpUH的底物特異性Table 2 Substrate specificity of cpUH

2.8 酶反應(yīng)動力學(xué)

以EC為底物,測定不同底物濃度下該酶的酶促反應(yīng)速率,并做出Lineweaver-Burk圖,結(jié)果如圖8所示。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法得到方程：y=1.796 4x+0.299(R2=0.997 4),計算得出該UH的Km值為6.01 mmol/L,Vmax為3.34 μmol/min。

圖8 假絲酵母cpUH催化氨基甲酸乙酯的Lineweaver-Burk圖Fig.8 Lineweaver-Burk plots of ethyl carbamate catalyzed by C.parapsilosis cpUH

3 結(jié)論與討論

本研究從假絲酵母中克隆了UH基因,并實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的考察,為后續(xù)的分子改造奠定了基礎(chǔ)。假絲酵母的UH基因大小為1 656 bp,編碼551個氨基酸；蛋白分子質(zhì)量約為60 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,cpUH酶促反應(yīng)的最適pH和溫度分別為7.5和40 ℃。cpUH在25～30 ℃具有較高的溫度穩(wěn)定性。cpUH在pH 6.0～8.0具有較好的穩(wěn)定性,8 h以后仍能保持70%左右的酶活力。不同的金屬離子對UH影響不同,終濃度1 mmol/L的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Cu2+對cpUH的酶活力無激活作用,而Mn2+、Ca2+可以激活肺炎克雷伯氏菌的UH的酶活力[25],此外,EDTA對cpUH的酶活性無影響。底物特異性的考察表明,cpUH對EC的水解活性最強(qiáng),氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯的水解活性依次減小,對乙酰胺、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺具有較強(qiáng)的水解作用,而來自于賴氨酸芽孢桿菌的UH,其隨著底物碳鏈長度的增加,酶活力減小,對苯甲酰胺和谷氨酰胺沒有降解效果[21]。cpUH對鹽和乙醇的耐受性研究發(fā)現(xiàn),其具有良好的乙醇耐受性,4 ℃保溫4 h后,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時,其殘余酶活力為50%左右,這可為其在低酒精度的黃酒中使用提供參考。此外,本文還研究了cpUH的酶反應(yīng)動力學(xué),發(fā)現(xiàn)其Km值為6.01 mmol/L,相比較于變幻青霉[26](Km為27.2 mmol/L)及賴氨酸芽孢桿菌[21](Km為37.2 mmol/L)對EC具有較強(qiáng)的親和力。