孟愛蓮,陳媛媛,馬嫄,劉曉翠,文學菊,劉萍,袁安琪,葉坤月

(西華大學 食品與生物工程學院,四川 成都,611743)

糖尿病是一種常見的代謝疾病,餐后高血糖是Ⅱ型糖尿病的重要癥狀之一,高血糖可誘導多種蛋白的非酶糖基化,導致糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生[1]。Ⅱ型糖尿病與機體氧化損傷有著密切關(guān)聯(lián),Ⅱ型糖尿病患者機體的抗氧化水平顯著低于正常人體[2]。所以控制餐后血糖飆升對于糖尿病的治療和減少慢性血管并發(fā)癥至關(guān)重要。合成的α-葡萄糖苷酶抑制藥物已廣泛應用于糖尿病患者。但是一些合成α-葡糖苷酶抑制劑的副作用比較明顯,因此亟待為糖尿病患者提供天然的降血糖產(chǎn)品及藥物,實現(xiàn)多途徑的降血糖作用。

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是參與人體對食物中淀粉吸收過程的重要酶類,α-葡萄糖苷酶抑制劑競爭性抑制位于小腸的各種α-葡萄糖苷酶,使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢,從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收,抑制α-葡萄糖苷酶催化的多糖降解為單糖,起到緩解碳水化合物迅速分解為葡萄糖的作用,從而達到調(diào)節(jié)糖尿病患者餐后血糖的作用[3-5]。α-淀粉酶是碳水化合物消化吸收的關(guān)鍵酶,能隨機水解α-1,4糖苷鍵,消化淀粉,促進糖吸收,α-淀粉酶抑制劑是一種新型的治療糖尿病的藥物。α-淀粉酶抑制劑能與α-淀粉酶分子上的相應部位結(jié)合并改變α-淀粉酶分子構(gòu)象,降低它的催化活性或使之喪失[6]。

苦筍是禾本科竹亞科苦竹屬苦竹(Pleioblastusamarus)的幼芽,味苦而后甜,是天然的高蛋白、高膳食纖維、低脂型可食性森林蔬菜,同樣也兼具著藥用效果[7]?？喙S富含黃酮類、酚酸類、生物堿類、苯環(huán)衍生物及多種微量元素成分,具有抗炎、抗菌、降血糖和降血脂等作用[8]。目前對苦筍的研究主要集中在筍肉的保鮮、膳食纖維的處理以及亞硝化反應等活性方面的研究[9-10]。對苦筍殼的活性物質(zhì)以及對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性的研究報道很少,本研究旨在為開發(fā)天然的苦筍殼降血糖食品提供理論支撐,促進苦筍產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

苦筍,四川宜賓；α-葡萄糖苷酶來源于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae,EC 3.2.1.20≥100 units/mg protein)、對硝基苯基-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG,98%)、豬胰α-淀粉酶(來源于豬胰腺,EC 3.2.1.1≥100 units/mg protein),美國sigma公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spectra Max M2e多功能酶標儀,美國Molecular Devices公司；KH3200E型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；A—1000S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機,東京理化器械株式會社；5424型臺式離心機,德國Eppendorf公司。

2 實驗方法

2.1 苦筍前處理

苦筍殼水提物的制備：苦筍殼20 g粉碎,過60目篩,以10倍的熱水浸泡40 min,超聲波浸提24 h,過濾、合并濾液,濃縮,真空干燥,加入適量的蒸餾水,超聲波助溶,配制成質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的溶液。

苦筍殼醇提物的制備：苦筍殼20 g粉碎,以10倍體積分數(shù)70%乙醇浸泡40 min,回流提取2次,第1次1.5 h,第2次8倍的70%乙醇1 h?；亓魍戤?過濾、合并濾液,水浴上揮發(fā)至無醇味,濃縮,真空干燥,加入適量的70%乙醇,超聲波助溶,配制成質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的溶液。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測試

參照LI等[11]的研究方法分析苦筍提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性,將不同濃度的樣品或阿卡波糖溶液(50 μL)與α-葡萄糖苷酶(50 μL,0.2U/mL,用 0.1 mmol/L,pH 6.9 PBS配制)在25 ℃溫育6 min,然后加入pNPG溶液(50 μL,5 mmol/L),在25 ℃溫育10 min后,將Na2CO3溶液(100 μL 0.2 mol/L)混合以終止反應,并使用酶標儀測量405 nm處的吸光度,α-葡萄糖苷酶的抑制率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：AC,對照組的吸光度；AS,反應混合物的吸光度；Ab,混合物的吸光度；樣品和α-葡萄糖苷酶分別用蒸餾水/70%乙醇和0.1 mmol/L pH 6.9 PBS代替。實驗重復3次。

2.3 α-淀粉酶抑制活性測試

參照張凱等[12]方法，混合37 ℃水浴預熱5 min,同時加入已預溫的1%淀粉溶液(PBS配制)0.3 mL,在37 ℃水浴下反應一定的時間,立即加入0.5 mL DNS溶液顯色,在沸水中水浴5 min,冷卻后經(jīng)蒸餾水稀釋至10 mL,在540 nm處測定吸光值(A3)。用阿卡波糖(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)做陽性對照組,蒸餾水替代抑制劑及磷酸鹽緩沖溶液(67 mmol/L pH 6.8)替代α-淀粉酶(A2)做空白對照物；磷酸鹽緩沖溶液替代α-淀粉酶(A4)做背景對照組；以蒸餾水替代抑制劑(A1)做空白組。抑制率的計算如公式(2)所示。做3次平行實驗,根據(jù)抑制率計算得IC50。

(2)

式中：A1,0.3 mL酶液+0.3 mL淀粉溶液+0.5 mL DNS溶液；A2,0.3 mL淀粉溶液+0.5 mL DNS溶液；A3,0.3 mL酶液+乙酸乙酯提取物+0.3 mL淀粉溶液+0.5 mL DNS溶液；A4,乙酸乙酯提取物+0.3 mL淀粉溶液+0.5 mL DNS溶液。

2.4 對α-葡萄糖苷酶抑制動力學試驗

以對α-葡萄糖苷酶抑制活性最強相為抑制劑,α-葡萄糖苷酶抑制動力學實驗參照文獻[13]的方法進行。以底物濃度倒數(shù)(1/[S])為橫坐標,反應速率倒數(shù)(1/V)為縱坐標進行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖分析,求得米氏常數(shù)Km和酶促反應最大速率Vmax,確定抑制類型及競爭方式[14]。最大反應速率Vmax和米氏常數(shù)Km計算如公式(3)、公式(4)所示：

V=Vmax[S]/(Km+[S])

(3)

1/V=Km/Vmax×1/[S]+1/Vmax

(4)

2.5 對α-淀粉酶抑制動力學試驗

以對α-淀粉糖苷酶抑制活性最強相為抑制劑,乙酸乙酯相對α-淀粉酶抑制類型研究按照上述2.3中實驗方法進行操作,在空白管中使用0.3 mL緩沖液代替α-淀粉酶液,分別于540 nm處測定質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的苦筍殼提取物的吸光值,3組平行實驗。將酶濃度與反應速率作為橫縱坐標作圖,根據(jù)反應速率直線是否過原點,確定苦筍殼乙酸乙酯相對α-淀粉酶的抑制類型。分別配制淀粉溶液,按照2.3的試驗方法進行操作,分別在540 nm下測定苦筍殼乙酸乙酯相的吸光值,3組平行實驗。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法,判斷競爭方式。

2.6 統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示,運用SPSS 24.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析,采用origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析,試驗數(shù)據(jù)均為3次重復測定結(jié)果的平均值。采用單因素方差分析樣本間的差異顯著性,P<0.05表示顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 苦筍殼粗提物有效成分分析

苦筍殼中含有豐富的活性物質(zhì)如黃酮類、總酚、總糖,具有清除自由基和抗氧化、抗菌、防癌等多種生物活性作用。由圖1可知,水提和醇提2種方式活性物質(zhì)均為總糖含量最高,其中水提方式的總糖含量可達(97.3±0.28)%,而醇提方式的總糖含量只有(63.3±0.13)%,這是因為多糖具有較強的親水性,大多數(shù)多糖易溶于水,難溶于醇等有機溶劑,因而多糖多用水提取[15]。除總糖外,其他成分黃酮和總酚在醇提方式下的含量較高,說明苦筍中的活性物質(zhì)適合醇提,總酚和黃酮含量在醇提方式下差別不大。

圖1 不同提取方式有效成分的測定Fig.1 Content of active ingredients in different extraction methods

3.2 水提和醇提方式對α-葡萄糖苷酶的抑制活性比較

如圖2所示,隨著樣品濃度的增加,各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制的能力逐漸增強,可見提取物與抑制活性間呈現(xiàn)劑量-效應關(guān)系。在本試驗濃度內(nèi),苦筍醇提取物抑制活性>水提取物抑制活性,當提取物質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時,醇提方式抑制率可達90%。對α-葡萄糖苷酶的抑制能力大小：醇提[IC50=(0.091±0.013) mg/mL]>水提[IC50=(0.130±0.010) mg/mL],醇提方式表現(xiàn)出極強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。而水提方式較弱的主要原因可能是熱水浸提以及超聲波破壞多糖的分子鏈從而使其活性受到破壞[16]。

圖2 不同提取方式對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.2 Inhibition of α-glucosidase by different extraction methods

3.3 醇提方式有效成分分析

萃取相極性不同,對植物活性物質(zhì)的提取效果也不同。由表1可以看出,活性物質(zhì)含量：乙酸乙酯萃取相活性物質(zhì)含量>正丁醇萃取相>石油醚萃取相,有研究表明,極性強的溶劑如乙酸乙酯、正丁醇能夠有效提取含糖苷的多酚和黃酮類化合物[17]。乙酸乙酯萃取相的總酚含量達(193.00±2.65)mg GAE/100 g,而石油醚萃取相最低,為(139.83±5.06) mg GAE/100 g,說明在乙酸乙酯相中多酚、總糖類化合物極性較高。

表1 醇提物不同萃取相中總酚、總糖及總黃酮的含量 單位:mg GAE/100 g

3.4 醇提不同極性萃取相對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

在酶活力反應體系中,測定不同底物(pNPG)濃度條件下,各抑制活性具有較大差異,乙酸乙酯的抑制活性與阿卡波糖較接近,由圖3可以看出,抑制活性：乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,提取物質(zhì)量濃度在2 mg/mL 時對乙酸乙酯相α-葡萄糖苷酶的抑制活性為(97.32±0.67)%,對照阿卡波糖抑制活性為(94.32±1.21)%,乙酸乙酯相高于陽性對照,3種提取物抑制能力大小為乙酸乙酯[IC50=(0.158±0.001)mg/mL]>正丁醇[IC50=(0.211±0.008)mg/mL]>石油醚相[IC50=(0.280±0.005)mg/mL],說明苦筍殼中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯相中。

圖3 醇提物萃取相對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Fig.3 Alcohol extract relative α-glucosidase inhibitory activity

3.5 不同極性萃取相對α-淀粉酶抑制活性的影響

如圖4所示,隨著醇提物質(zhì)量濃度的增加,抑制率也逐漸增加,阿卡波糖陽性對照組,在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對α-淀粉酶的抑制率均達到90%,起初增幅較大,隨后變得較為平緩,近似于拋物線,這與何貝橋等[18]研究葫蘆茶提取物對α-淀粉酶抑制速率圖結(jié)果保持一致。當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,乙酸乙酯的抑制率為(92.21±0.45)%,其IC50=(0.104±0.006)mg/mL。陽性藥物阿卡波糖的抑制率達到(98.13±0.85)%,其IC50=(0.094±0.005)mg/mL,乙酸乙酯萃取相與阿卡波糖的抑制率接近,說明乙酸乙酯萃取相對α-淀粉酶具有一定的抑制效果。

圖4 醇提物萃取相對α-淀粉酶抑制活性的影響Fig.4 Alcohol extract relative α-amylase inhibitory activity

3.6 醇提物抗氧化能力測定

醇提物不同萃取相的抗氧化能力(以Trolox或維生素C為陽性對照)見表2。苦筍殼在3種不同萃取相中均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。各萃取相對3種自由基的清除能力均是：·OH>ABTS陽離子自由基>DPPH自由基,在苦筍殼中乙酸乙酯相中,·OH的清除能力最強,與Trolox的抗氧化能力相似?？偪寡趸芰Ψ矫妫阂宜嵋阴ハ?正丁醇相>石油醚相,石油醚相提取物主要包含脂溶性物質(zhì),包括脂肪以及維生素和色素(石油醚相提取物主要包含脂肪、維生素以及色素等脂溶性物質(zhì)),對抗氧化性沒有起到主要作用。說明苦筍殼中發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯相中。

表2 醇提物不同萃取相的抗氧化能力測定Table 2 Determination of antioxidant ability of different extraction phases of alcohol extract

3.7 乙酸乙酯萃取相對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制類型

苦筍乙酸乙酯提取物對α-葡萄苷酶、α-淀粉酶抑制動力學擬合曲線如圖5、圖6所示,在反應過程中沒有提取物存在時,反應速率大約是一條經(jīng)過原點的直線,在原反應體系中加入酶抑制劑提取物后,反應速度隨著酶量的多少及加入酶抑制劑后的變化而不同,由圖5，圖6可知,加入乙酸乙酯提取物后得到的反應速率直線通過原點,且斜率低于無抑制劑的曲線,由此可以看出,苦筍提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制類型屬于可逆抑制類型,這是由于苦筍乙酸乙酯提取物與底物共同競爭同一位置,使得提取物與α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶結(jié)合,且酶不再與底物結(jié)合,從而降低反應速率,且產(chǎn)物形成可逆[19]。

圖5 乙酸乙酯提取物對α-葡萄糖酶抑制類型 Lineweaver-Burk曲線Fig.5 Lineweaver-Burk curve of the inhibition type of ethyl acetate extract on α-glucase

圖6 乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶抑制類型 Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk curve of the inhibition type of ethyl acetate extract on α-amylase

3.8 乙酸乙酯相對α-葡萄糖苷酶可逆抑制類型

利用Lineweaver-Burk作圖法研究苦筍乙酸乙酯提取物對α-葡萄糖苷酶的可逆性抑制,由圖7可知,苦筍乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL得到的直線與未加抑制劑組的直線相交縱軸的一點,苦筍乙酸乙酯提取物直線斜率大于未加抑制劑組,提取物回歸方程為：y=22.96x+38.01(R2=0.996 1,Vmax=0.026,Km=0.601)；未加抑制劑回歸方程：y=10.3x+37.83(R2=0.989 1,Vmax=0.026,Km=0.256),Vmax基本保持不變,Km增大,乙酸乙酯萃取相和底物對游離的α-葡萄糖苷酶的結(jié)合有競爭作用,相互排斥與α-葡萄糖苷酶形成可逆的復合物,乙酸乙酯萃取相與底物競爭酶的活性中心,從而阻止底物與酶的結(jié)合,使反應速度下降[20]。即乙酸乙酯醇提物對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制。

圖7 乙酸乙酯提取物對α-葡萄糖苷酶抑制類型 Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curve of the inhibition type of ethyl acetate extract on α-glucosidase

3.9 乙酸乙酯相對α-淀粉酶可逆抑制類型

由圖8可知,1/[S]與1/[V]存在良好的線性關(guān)系,隨著1/[S]逐漸增大,苦筍殼乙酸乙酯萃取組的反應速度低于無抑制劑的反應速度,兩者線性回歸方程延長線近似交于橫坐標同一點,苦筍殼乙酸乙酯萃取組直線斜率大于無抑制劑組,在縱軸上的截距也增加(無抑制劑回歸方程：y=21.67x+40.68,R2=0.974,Vmax=0.025,Km=0.532；提取物回歸方程為：y=28.72x+54.47,R2=0.981,Vmax=0.018,Km=0.527),即最大反應速度Vmax減小,但Km幾乎保持不變,所以酶對底物的親和力不變。這表明底物和抑制劑與酶之間的結(jié)合沒有競爭性,苦筍殼乙酸乙酯提取物通過與酶的活性位點以外的基團結(jié)合,使分子形狀發(fā)生改變,抑制劑大部分與巰基結(jié)合,破壞酶的構(gòu)象,從而降低酶活力,該現(xiàn)象稱為非競爭性抑制,說明苦筍殼提取物中能抑制α-淀粉酶的組分較單一或是結(jié)構(gòu)相似的一類化合物[21]。

圖8 乙酸乙酯提取物對α-淀粉酶抑制類型 Lineweaver-Burk曲線Fig.8 Lineweaver-Burk curve of the inhibition type of ethyl acetate extract on α-amylase

4 結(jié)論

苦筍殼經(jīng)水提和70%乙醇提取都含有總酚、總糖和黃酮類物質(zhì),其中水提物總糖含量較高,醇提物中黃酮和總酚含量較高。不同萃取溶劑的極性對苦筍殼的抗氧化活性有顯著的影響：醇提的3個不同萃取溶劑中,乙酸乙酯相對清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH能力>正丁醇相和石油醚相,說明苦筍殼乙酸乙酯相的抗氧化能力大于石油醚相和正丁醇相。酶動力學分析顯示,苦筍殼乙酸乙酯萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制,Vmax=0.026；對α-淀粉酶的抑制類型為非競爭性抑制,Km=0.527～0.532,苦筍殼粗提物及不同極性部位表現(xiàn)出一定的抗氧化作用和對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制作用,余穎等[22]研究甘草酸提取廢液萃取物中,乙酸乙酯萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強為競爭性抑制。有研究表明非競爭性抑制劑與競爭性抑制劑之間存在著協(xié)同α-葡萄糖酶活性的作用[23]。周曉婷等[24]對苦蕎粗提物進行萃取,發(fā)現(xiàn)實驗組中的苦蕎提取物對α-淀粉酶的抑制類型為非競爭性抑制。不同極性苦筍殼提取物間的相互作用的研究尚不明確,對苦筍殼中主要發(fā)揮功效作用的具體單體物質(zhì)還需要進一部分離純化,做進一步研究,本研究可對開發(fā)具有輔助降血糖的產(chǎn)品提供理論依據(jù)。