馬麟 張昕 陳煥鑫 周海玲 李嘉琪 王羚酈

[摘要] 目的 研究沉香提取液對(duì)胃潰瘍組織的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 方法 將60只SPF級(jí)的SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（不予處理），模型組（等體積生理鹽水），陽(yáng)性對(duì)照組（蘭索拉唑0.003 g/mL），沉香提取液低（0.4 g/mL）、中（0.8 g/mL）、高（1.6 g/mL）劑量組，給藥劑量均為1 mL/100 g，每組10只。灌胃無(wú)水乙醇1 mL建立急性胃黏膜損傷模型，陽(yáng)性對(duì)照組和沉香提取液各給藥組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。采用免疫組化檢測(cè)大鼠胃組織中Bcl-2和Bax的含量。采用試劑盒檢測(cè)大鼠血清中氧化因子微量丙二醛（MDA）的含量以及抗氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）、微量還原性谷胱甘肽（GSH）的活性。 結(jié)果 與正常組比較，模型組胃組織Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)上升（P < 0.05）。與模型組比較，沉香提取液各給藥組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上升，Bax蛋白表達(dá)明顯減少（P < 0.05）。與模型組比較，沉香提取液各給藥組能有效提高血清中SOD和GSH活性，降低MDA含量（P < 0.05）。 結(jié)論 沉香提取液可能通過(guò)升高胃組織中Bcl-2蛋白表達(dá)、減少Bax蛋白表達(dá)、提高血清中SOD和GSH活性、降低MDA含量來(lái)改善無(wú)水乙醇致大鼠的胃潰瘍。

[關(guān)鍵詞] 沉香;抗胃潰瘍;免疫組化;作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R737.14? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（c）-0015-04

[Abstract] Objective To study the protective effect of Chinese eaglewood extract on gastric ulcer tissue and its mechanism. Methods Sixty SPF Sprague-Dawley （SD） male rats were divided into normal group （not to deal with）， model group （equal volume of normal saline）， positive control group （Lansoprazol 0.003 g/mL）， Chinese eaglewood extract low （0.4 g/mL）， medium （0.8 g/mL） and high （1.6 g/mL） dose groups by random number table method， the dosage of each group was 1 mL/100 g， with 10 rats in each group. The acute gastric mucosal injury model was established by intragastric administration of anhydrous ethanol 1 mL. The positive control group and Chinese eaglewood extract groups were given intragastric administration once a day for 7 days. The contents of Bcl-2 and Bax were examined by immunohistochemical method. The kit was used to detect the content of oxidative factor malondialdehyde （MDA） and the activity of antioxidant factor superoxide dismutase （SOD） and trace reduced glutathione （GSH） in rat serum. Results Compared with the normal group， the expression of Bcl-2 protein in the gastric tissue of the model group decreased， and the expression of Bax protein increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the expression of Bcl-2 in the gastric tissue of Chinese eaglewood extract groups increased， and the expression of Bax protein decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the activity of SOD and GSH of Chinese eaglewood extract groups increased and the content of MDA decreased （P < 0.05）. Conclusion Chinese eaglewood extract can improve the gastric ulcer induced by absolute ethanol through increasing the expression of Bcl-2 protein in gastric tissue， reducing the expression of Bax protein， improving the activity of serum SOD and GSH and decreasing the content of MDA.

[Key words] Chinese eaglewood; Anti gastric ulcer; Immunohistochemistry; Mechanism

沉香為瑞香科植物白沉香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含有樹(shù)脂的木材[1]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為沉香具有行氣止痛、納氣平喘、溫中止嘔的作用，歸胃經(jīng)，臨床上治療胃痛、腹痛、嘔吐等癥狀。該藥材含有黃酮類、酚類等多種活性成分，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[2]。其中，沉香在臨床應(yīng)用上具有保護(hù)消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[3-5]。消化性潰瘍是由于侵襲因子（Hp感染、胃酸和胃蛋白酶作用、非甾體類抗炎藥等）與防御因素（胃黏液-重碳酸鹽屏障、黏膜屏障、黏膜血流因素等）之間平衡失調(diào)所致，其是一個(gè)世界性范圍的胃腸道疾病，對(duì)人類健康危害極大[6]。盡管沉香在消化系統(tǒng)上的應(yīng)用較多，但目前沉香對(duì)消化系統(tǒng)的作用機(jī)制尚不明確[7]。因此，進(jìn)一步深入探究沉香藥理作用及其作用機(jī)制，對(duì)擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍具有深遠(yuǎn)意義。本研究通過(guò)建立無(wú)水乙醇實(shí)驗(yàn)性潰瘍的動(dòng)物模型，利用免疫組化測(cè)定胃組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，相應(yīng)試劑盒測(cè)定血清中氧化及抗氧化因子水平，旨在研究沉香提取液對(duì)胃潰瘍組織的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠（體重180～200 g，49～56日齡）60只，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)為44007200046214。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，墊料每日更換1次，自由攝食和飲水，動(dòng)物房保持室內(nèi)溫度20～26℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每日光照12 h。在給藥前12 h開(kāi)始禁食，自由飲水;造模前12 h，大鼠只禁食不禁水，造模給藥前稱重。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑? 95%乙醇（色譜級(jí)，天津市大茂化學(xué)試劑廠）;甲醇（色譜級(jí)，天津市福晨化學(xué)試劑廠）;蘭索拉唑腸溶片（汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)鮀濱制藥廠，批號(hào)：1010598750）;水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：5115259）;大鼠Bax和Bcl-2抗體免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為C10099370、C10099867）;微量丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：1170091）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：1162017）、微量還原性谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號(hào)：1132501）均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器? 島津AUY120分析天平（精確度0.000 01）;賽默飛HistoSta組織包埋機(jī);賽默飛STP120組織脫水機(jī);賽默飛Gemini AS自動(dòng)染色機(jī);賽默飛HM340E石蠟切片機(jī);奧林巴斯BX53熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥? 將60只雄性SD大鼠[體重（180±20）g]按隨機(jī)數(shù)字表法分為六組，即正常組（不予處理），模型組（給予1 mL/100 g生理鹽水），陽(yáng)性對(duì)照組（給予蘭索拉唑濃度為0.003 g/mL，給藥劑量為1 mL/100 g），沉香提取液低、中、高劑量組（濃度分別為0.4、0.8、1.6 g/mL，給藥劑量為1 mL/100 g）。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)前處理? 除正常組外，其余各組每只大鼠灌胃無(wú)水乙醇1 mL造成急性胃黏膜損傷，之后陽(yáng)性對(duì)照組和沉香提取液各給藥組每天灌胃給藥1次，模型組給予同等劑量生理鹽水，連續(xù)7 d，于最后1次給藥1 h后，麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置2 h，離心10 min（r = 6 cm），血清保存于-80℃待用。再腹腔取大鼠胃組織，沿胃大彎剪開(kāi)胃，清洗胃組織后，切取適量體積胃組織，裝入甲醛溶液中保存，待制片。

1.3.3 取材與固定? 準(zhǔn)確地取胃組織塊解剖部位體積2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，用水沖洗干凈組織塊上的污物，再放入配置好的固定液中，標(biāo)本與固定液的比例為1∶4～1∶20，適當(dāng)?shù)捏w積有利于樣品的觀察及固定液的滲透和染液的滲透。

1.3.4 脫水透明? 標(biāo)本經(jīng)過(guò)固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，先后以80%、90%、95%、100%乙醇各洗脫2 h。本次實(shí)驗(yàn)使用的透明劑是二甲苯。

1.3.5 浸蠟、包埋? 將石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑，浸入的時(shí)間稍微延長(zhǎng)一些，使石蠟盡可能地浸入組織中;浸蠟后置于融化的固體石蠟中，待凝固后修齊蠟塊，固定于木塊上，包埋完成。

1.3.6 切片和貼片? 主要步驟：修整蠟塊、準(zhǔn)備好切片用具、安裝蠟塊、安裝切片刀（控制切片厚度為4～6 μm）、切片、鋪片、貼片，最后置入60～65℃恒溫箱內(nèi)中烘片2 h，脫去溶化組織間隙的石蠟，封片。

1.3.7 樣品的免疫組化處理? 切取固定的胃組織，分別進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片、載片、烘片、脫蠟，之后按免疫組化試劑盒的說(shuō)明書步驟滅活內(nèi)源性酶、滴加消化液、山羊血清封閉液、生物素、SABC，最終用DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片即得。所得到的切片運(yùn)用image pro plus分析軟件分別計(jì)算切片的染色面積（IOD），并以每個(gè)切片的平均染色面積（IOD/Area）為最終結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.8 大鼠血清中GSH、SOD、MDA水平的測(cè)定? 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書步驟，分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中按步驟先后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體、洗滌液、底物、終止液等。最后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，根據(jù)說(shuō)明書公式，將OD值換算成最終的GSH、SOD和MDA的濃度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則行進(jìn)一步兩兩比較，采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

單因素方差分析結(jié)果顯示，各組大鼠胃組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與正常組比較，模型組中胃組織Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，沉香提取液各給藥組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高（P < 0.05），染色面積較大，其中高劑量組中Bcl-2蛋白表達(dá)優(yōu)勢(shì)最明顯;Bax蛋白表達(dá)明顯降低（P < 0.05），染色面積較小，且隨著給藥劑量的增加而逐步減少。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清中GSH、SOD活性和MDA含量比較

單因素方差分析結(jié)果顯示，各組大鼠血清中GSH、SOD活性和MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與正常組比較，模型組GSH、SOD活性顯著下降，MDA含量明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與模型組比較，沉香提取液各給藥組GSH、SOD活性均顯著升高（P < 0.05），MDA含量顯著降低（P < 0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。見(jiàn)表2。

3 討論

免疫組化是一種方法學(xué)，由最初的免疫熒光直接標(biāo)記法逐步出現(xiàn)了間接法、免疫酶法、親和細(xì)胞化學(xué)方法、免疫膠體金法、多聚物酶法（或稱非生物素放大法）、CSA法、酶標(biāo)記熒光法和原位免疫PCR法及循環(huán)放大（RCA）法等。該技術(shù)具有高度特異性，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開(kāi)展深入研究十分有意義[8-9]。

在本研究中，決定胃黏膜細(xì)胞凋亡的蛋白Bax、Bcl-2存在著一定的聯(lián)系。當(dāng)發(fā)生潰瘍時(shí)，促凋亡基因Bax與抗凋亡基因Bcl-2失衡[10-11]，而沉香提取液能顯著提高胃黏膜Bcl-2蛋白表達(dá)，同時(shí)降低Bax蛋白表達(dá)，使兩種蛋白恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡，從而達(dá)到修復(fù)潰瘍的目的[12-13]。本研究中，模型組胃組織Bcl-2表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增多（P < 0.05）;與模型組比較，沉香提取液低、中、高劑量組胃組織中Bcl-2蛋白明顯升高（P < 0.05），其中，沉香提取液高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)優(yōu)勢(shì)最明顯，沉香提取液低、中、高劑量組Bax蛋白表達(dá)降低（P < 0.05），且隨著給藥劑量的增加而逐步減少。

研究表明，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和氧自由基貫徹了慢性胃炎、胃潰瘍和胃癌等疾病的整個(gè)發(fā)病歷程，與消化性疾病息息相關(guān)[14]。機(jī)體胃組織布滿了血管，有著充足的供血，當(dāng)胃組織受到外來(lái)物質(zhì)刺激或條件應(yīng)激時(shí)，可產(chǎn)生大量氧自由基，這些物質(zhì)能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，加重胃黏膜損害[15]，而脂質(zhì)過(guò)氧化水平常用于評(píng)價(jià)自由基產(chǎn)生水平及胃黏膜組織損傷的嚴(yán)重程度。SOD是存在于機(jī)體中的抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基，降低由于氧自由基所帶來(lái)的對(duì)細(xì)胞的傷害，同時(shí)還能修復(fù)受損細(xì)胞[16]。因此，SOD常用于考察清除氧自由基能力和胃黏膜保護(hù)作用[17]。MDA是脂質(zhì)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的過(guò)氧化物，氧自由基引起多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化是其導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞損傷的重要因素[18]。胃組織中MDA的水平可以側(cè)面反映組織受氧化損傷的嚴(yán)重程度，MDA是胃黏膜的攻擊因子[19-20]。

本研究通過(guò)無(wú)水乙醇應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠，建立急性實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型，利用沉香提取液進(jìn)行藥物干預(yù)，利用免疫組化檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的變化趨勢(shì)，探究沉香提取液對(duì)于預(yù)防潰瘍的機(jī)制。同時(shí)測(cè)定不同組別的大鼠氧化和抗氧化因子SOD、GSH、MDA的含量變化，初步探討沉香提取液對(duì)潰瘍組織的保護(hù)作用及可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，沉香提取液對(duì)無(wú)水乙醇所致胃潰瘍有一定的保護(hù)作用。

然而，本研究只限于評(píng)價(jià)沉香提取液對(duì)無(wú)水乙醇所致的急性胃損傷的保護(hù)作用，而關(guān)于其是否對(duì)慢性炎癥或其他胃攻擊因子造成的胃黏膜損傷模型具有保護(hù)作用仍有待進(jìn)一步的研究。因此，今后可通過(guò)建立各種炎癥和胃潰瘍模型對(duì)本文所獲得的結(jié)論加以印證，以便更全面地評(píng)價(jià)沉香提取液抗胃潰瘍活性，為沉香的臨床治療胃潰瘍提供理論指導(dǎo)。

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（收稿日期：2018-12-07? 本文編輯：張瑜杰）