李 強(qiáng)，周 柯，孫 菲

(1. 空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員五大隊(duì)十九隊(duì)，陜西 西安 710032； 2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科 全軍臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032； 3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，陜西 西安 710032)

鼻腔共生菌群是人體正常菌群的一部分，在維持宿主正常生理功能中具有重要作用，但此類菌群在特定情況下可轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)致病菌引發(fā)機(jī)體感染[1]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一種對(duì)人類致病的革蘭陽(yáng)性球菌，具有多種毒力因子，是引起社區(qū)和醫(yī)院感染的重要病原菌。SA可長(zhǎng)期或間斷定植在部分人群的鼻前庭(前鼻孔)內(nèi)，與其他鼻腔微生物一并構(gòu)成鼻腔共生菌群，可轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)致病菌并引發(fā)機(jī)體感染。當(dāng)鼻腔定植的SA轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位，可引起皮膚軟組織、手術(shù)切口、呼吸道、骨關(guān)節(jié)、血流等感染[2-3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是重要的醫(yī)院感染多重耐藥菌，所致感染常難以治療，且在社區(qū)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)人群的分離率有逐漸升高趨勢(shì)。開展特定人群鼻腔定植SA和其他條件致病菌的篩查，對(duì)于預(yù)防潛在的SA感染，其他條件致病菌所致的感染和醫(yī)院感染都具有重要意義。

本研究通過(guò)植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子對(duì)在某院進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)課程學(xué)習(xí)的161名健康本科生進(jìn)行鼻前庭標(biāo)本采集，通過(guò)微生物自動(dòng)化系統(tǒng)接種于各類細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和菌落觀察，并通過(guò)細(xì)菌鑒定從而確定鼻腔SA和其他可培養(yǎng)共生菌的定植情況，通過(guò)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)SA耐藥表型，為鼻腔定植條件致病菌特別是SA的快速篩查及其感染控制提供新的方法和理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年2—3月在空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)課程學(xué)習(xí)的2016級(jí)臨床醫(yī)學(xué)、心理學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)本科學(xué)員。所選對(duì)象均為健康青年人群，并對(duì)有下列情況之一者予以排除：(1)近1個(gè)月內(nèi)使用抗菌藥物；(2)近1個(gè)月內(nèi)患急、慢性呼吸系統(tǒng)疾??；(3)上頜竇漏、牙源性鼻竇炎或真菌性變應(yīng)性鼻竇炎者。項(xiàng)目通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY20193286)。

1.2 材料與設(shè)備 eSwab含轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基植絨拭子(簡(jiǎn)稱為植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子)、WaspLab微生物自動(dòng)化系統(tǒng)購(gòu)于意大利Copan，羊血瓊脂培養(yǎng)基、含萬(wàn)古霉素巧克力瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白(MH)藥敏瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)于鄭州安圖生物，Vitek-GP革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡片、AST-GP67革蘭陽(yáng)性菌藥敏卡片、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀、Vitek MS微生物質(zhì)譜鑒定儀、質(zhì)譜靶板和基質(zhì)液購(gòu)于法國(guó)Biomerieux，抗菌藥物藥敏紙片購(gòu)于英國(guó)Oxoid，質(zhì)控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、ATCC 25923購(gòu)于國(guó)家微生物菌種保藏中心，Vitek MS質(zhì)譜儀質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 8739由儀器生產(chǎn)商提供。

1.3 鼻前庭樣本采集 拆開植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子獨(dú)立包裝，打開含轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基的保存管螺旋蓋，用eSwab植絨拭子蘸取轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基使拭子頭濕潤(rùn)，將其依次插入患者雙側(cè)鼻前孔約2 cm，每個(gè)鼻孔分別以順時(shí)針和逆時(shí)針緩慢旋轉(zhuǎn)2～5次，需要注意應(yīng)輕柔擦拭鼻黏膜組織以保證采集到黏膜上皮細(xì)胞。采集完畢將植絨拭子插入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基保存管，在植絨拭子柄中部折斷并棄去手持部分，蓋好保存管螺旋蓋，室溫下保存，24 h內(nèi)送達(dá)檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.4 標(biāo)本接種培養(yǎng)和菌落判讀 植絨轉(zhuǎn)運(yùn)拭子通過(guò)手工接種或Wasp Lab微生物自動(dòng)化系統(tǒng)預(yù)先設(shè)置的接種模式，分別接種于羊血、巧克力、麥康凱瓊脂，35℃ 5% CO2孵箱培養(yǎng)16 h和40 h進(jìn)行自動(dòng)培養(yǎng)基拍攝，并通過(guò)系統(tǒng)影像工作站軟件進(jìn)行菌落觀察，對(duì)生長(zhǎng)菌落進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并根據(jù)需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。如暫無(wú)病原菌生長(zhǎng)，則繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)至40 h后自動(dòng)進(jìn)行第二次拍攝和菌落觀察，防止漏檢。

1.5 細(xì)菌鑒定 采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)進(jìn)行菌株鑒定。根據(jù)Vitek MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，用一次性1 μL接種環(huán)挑取單個(gè)待測(cè)菌落，均勻涂布在靶板檢測(cè)點(diǎn)上制成厚度適中的菌膜，用微量移液器吸取1 μL基質(zhì)液覆蓋于菌膜之上。將ATCC 8739質(zhì)控菌株菌落涂布于靶板質(zhì)控點(diǎn)，待所有菌膜基質(zhì)液干燥后，靶板裝載入Vitek MS進(jìn)行鑒定，獲得待測(cè)菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

1.6 藥敏試驗(yàn) 執(zhí)行自動(dòng)化儀器法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)分離的SA菌株的耐藥表型，以一次性棉拭子挑取足量疑似SA菌落，無(wú)菌生理鹽水配置0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，用AST-GP67革蘭陽(yáng)性菌藥敏卡片通過(guò)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定藥敏儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏結(jié)果依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)藥敏試驗(yàn)2018年 M100-28th標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果，其中苯唑西林最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL時(shí)判斷為MRSA，苯唑西林MIC≤2 μg/mL為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)。

2 結(jié)果

2.1 鼻腔定植菌檢出情況 共采集161名健康軍校本科生的鼻前庭標(biāo)本，其中男性140名，女性21名，年齡20～22歲。檢出可培養(yǎng)定植細(xì)菌549株，未檢出真菌。其中革蘭陽(yáng)性菌493株，居前三位的菌為擁擠棒狀桿菌(151株)、表皮葡萄球菌(150株)、假白喉棒狀桿菌(54株)，檢出金黃色葡萄球菌41株(鼻腔SA定植率為25.46%)；革蘭陰性菌56株，居前三位的菌為肺炎克雷伯菌(13株)、產(chǎn)氣腸桿菌(13株)、莫拉菌屬(12株)。見表1。鼻前庭標(biāo)本同時(shí)分離的細(xì)菌種類2～6種不等，共有72種不同的帶菌模式，以同時(shí)檢出金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和擁擠棒狀桿菌帶菌模式的學(xué)員最多，達(dá)21名(13.04%)。鼻前庭常見的五種定植菌模式見表2，鼻腔定植菌在血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況見圖1。

表1軍醫(yī)大學(xué)本科生鼻腔定植菌檢出情況

Table1Detection result of nasal colonized bacteria of military medical university students

細(xì)菌名稱檢出株數(shù)構(gòu)成比(%)革蘭陽(yáng)性菌49389.80 金黃色葡萄球菌 41 7.47 表皮葡萄球菌15027.32 溶血葡萄球菌 8 1.46 科氏葡萄球菌 4 0.73 頭狀葡萄球菌 4 0.73 擁擠棒狀桿菌151 27.51 假白喉棒狀桿菌 54 9.84 懶惰狡詐球菌 38 6.92 蠟樣芽孢桿菌 32 5.83 短芽孢桿菌 1 0.18 藤黃微球菌 2 0.36 里拉微球菌 1 0.18 肺炎鏈球菌 1 0.18 緩癥鏈球菌 4 0.73 微黃奈瑟菌 2 0.36 革蘭陰性菌 56 10.20 大腸埃希菌 2 0.36 肺炎克雷伯菌 13 2.37 產(chǎn)氣腸桿菌 13 2.37 產(chǎn)酸克雷伯菌 2 0.36 黏質(zhì)沙雷菌 3 0.55 陰溝腸桿菌 2 0.36 克氏檸檬酸桿菌 1 0.18 弗勞地檸檬酸桿菌 3 0.55 烏克曼檸檬酸桿菌 1 0.18 銅綠假單胞菌 1 0.18 流感嗜血桿菌 2 0.36 副流感嗜血桿菌 1 0.18 非液化莫拉菌 8 1.46 腔隙莫拉菌 1 0.18 奧斯陸莫拉菌 3 0.55 合計(jì)549100.00

表2軍醫(yī)大學(xué)本科生鼻前庭常見的五種定植菌模式

Table2Five common patterns of colonized bacteria in nasal vestibule of military medical university students

定植菌模式檢出人數(shù)構(gòu)成比(%)表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+金黃色葡萄球菌2113.04 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌1911.80 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+假白喉棒狀桿菌 9 5.59 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+假白喉棒狀桿菌+懶惰狡詐球菌95.59 表皮葡萄球菌+擁擠棒狀桿菌+蠟樣芽孢桿菌 8 4.97

A：經(jīng)鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和狡詐球菌菌落； B：經(jīng)鑒定為金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌和棒狀桿菌菌落； C：經(jīng)鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和腸桿菌科細(xì)菌菌落；拍攝時(shí)間均為培養(yǎng)40 h

圖1軍醫(yī)大學(xué)本科生鼻腔定植菌在血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況

Figure1Growth of nasal colonized bacteria on blood culture medium of military medical university students

表341株軍醫(yī)大學(xué)本科生鼻腔定植SA對(duì)抗菌藥物的耐藥情況

Table3Antimicrobial resistance of 41 strains of nasal colonized SA of military medical university students

抗菌藥物耐藥株數(shù)耐藥率(%)青霉素3278.05 苯唑西林717.07 慶大霉素 3 7.32 萬(wàn)古霉素00.00 替考拉寧 0 0.00 利奈唑胺00.00 四環(huán)素 2 4.88 多西環(huán)素00.00 紅霉素1741.46 替加環(huán)素 00.00 克林霉素1639.02 左氧氟沙星 24.88 復(fù)方磺胺甲口惡唑 4 9.76 利福平00.00

3 討論

SA屬于葡萄球菌屬，是引起人類和動(dòng)物疾病的重要病原菌，常分布在哺乳動(dòng)物鼻前庭、皮膚和黏膜中，約有50%人群長(zhǎng)期或間斷攜帶。SA可產(chǎn)生多種毒力因子，如黏附素、酶和毒素，以逃避宿主的免疫反應(yīng)。鼻前庭定植的SA可以轉(zhuǎn)移到皮膚或身體其他部位，引發(fā)毒素性疾病和化膿性感染等，因此，鼻腔定植的SA可能在其感染入侵時(shí)扮演了關(guān)鍵角色[3]。SA是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，主要引起皮膚軟組織感染、手術(shù)切口感染、醫(yī)院獲得性肺炎等。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)醫(yī)務(wù)人員、胰島素依賴型糖尿病患者、長(zhǎng)期接受血液透析患者、非法靜脈用藥患者鼻腔SA攜帶率高于正常人群。MRSA是指含有mecA基因或者抗菌藥物敏感性試驗(yàn)中苯唑西林MIC≥4 μg/mL的SA菌株，對(duì)除頭孢洛林以外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥以外，常對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥，已成為重要的醫(yī)院感染多重耐藥菌，其所致感染更加難以治療[2]。國(guó)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)已常規(guī)開展住院患者鼻腔MRSA定植篩查和去定植干預(yù)，對(duì)于醫(yī)院感染控制具有重要意義。在我國(guó)，對(duì)正常健康人群和醫(yī)務(wù)人員鼻腔SA和MRSA的定植率未開展大規(guī)模調(diào)查。本研究中161名健康軍醫(yī)大學(xué)本科生共檢出鼻腔可培養(yǎng)定植菌549株，其中包括41株SA，鼻腔SA定植率為25.46%，耐藥表型檢測(cè)提示鼻腔MRSA定植率為4.35%，接近于陳南菊等[7]報(bào)道的大學(xué)生鼻腔SA的定植率(26.24%)，高于劉軍(SA 10%)[8]、張亞莉(SA 16.1%)[9]和董宏亮(SA 5.16%，MRSA 1.72%)等[10]報(bào)道的臨床醫(yī)務(wù)人員鼻腔SA的定植率。開展醫(yī)務(wù)人員、易感患者鼻腔定植SA和MRSA的快速篩查和干預(yù)，可為SA感染防治及其醫(yī)院感染防控提供新的技術(shù)手段。

基于人類微生物組的研究提示，健康人鼻前庭含有鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、莫拉菌、奈瑟菌、嗜血桿菌屬等鼻腔共生菌[3]，是人體正常菌群的一部分，在維持宿主正常生理和免疫功能中發(fā)揮重要作用，能抑制病原體入侵和增殖。但在宿主免疫力低下、鼻腔共生菌群失衡時(shí)，可成為致病菌和耐藥菌的儲(chǔ)存庫(kù)，可轉(zhuǎn)化為機(jī)會(huì)/條件致病菌并引發(fā)機(jī)體感染[1]。本研究中健康大學(xué)生分離的鼻前庭共生菌群中，葡萄球菌、棒狀桿菌和狡詐菌屬的分離率較高。其中凝固酶陰性葡萄球菌如表皮葡萄球菌等，近年來(lái)逐漸被公認(rèn)為醫(yī)院感染病原菌，是導(dǎo)管相關(guān)血流感染、人工心臟瓣膜或血管植入、假體植入、腦脊液分流相關(guān)感染最常見病原體[3, 11]。擁擠棒狀桿菌是人體眼、耳、鼻和口咽部正常菌群，在臨床可引起主動(dòng)脈和二尖瓣心內(nèi)膜炎等感染[3]。假白喉棒狀桿菌是口咽微生物的一部分，有引起肺炎的臨床報(bào)道[3]。懶惰狡詐球菌可從呼吸道、眼和血標(biāo)本中分離，與醫(yī)院獲得性肺炎、敗血癥、急性膽囊炎伴胰腺炎、角膜炎、滑膜炎以及生物材料相關(guān)關(guān)節(jié)炎等感染性疾病相關(guān)[3, 12]。值得一提的是，凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌(不包括肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌)、棒狀桿菌(不包括白喉棒狀桿菌)、狡詐球菌、芽孢桿菌、微球菌、奈瑟菌(不包括腦膜炎奈瑟菌)、莫拉菌屬(不包括卡他莫拉菌)等，對(duì)于免疫功能正常者致病力較弱，可認(rèn)定為正常菌群[13]。而肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌可引起社區(qū)獲得性上呼吸道感染，認(rèn)為其屬于重要機(jī)會(huì)性致病菌。金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌本身的致病力和毒力較強(qiáng)，可在一定意義上歸屬于致病菌或機(jī)會(huì)性致病菌。埃希菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、檸檬酸桿菌屬屬于腸桿菌科細(xì)菌，在健康人群鼻腔的定植率較低，屬于機(jī)會(huì)性致病菌，在老年人群、住院患者鼻腔分離率會(huì)相對(duì)增高，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，有造成全身多系統(tǒng)感染的風(fēng)險(xiǎn)，其多重耐藥菌株所致感染常難以治療。盡管可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量繁雜，但仍然有大部分菌群無(wú)法在體外培養(yǎng)，包括鼻腔后部定植的厭氧微生物，如丙酸桿菌屬。本研究中，軍醫(yī)大學(xué)本科生鼻腔定植菌在構(gòu)成上保持了天然的正常菌群多樣性，與相關(guān)報(bào)道[8, 14-16]對(duì)醫(yī)務(wù)人員鼻腔定植菌的調(diào)查有所差異，而后者多為葡萄球菌屬、腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌等致病菌或多重耐藥菌，失去了菌群多樣性。

鼻腔共生菌群具有造成人體自身機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)，而醫(yī)務(wù)人員鼻腔定植菌極易通過(guò)醫(yī)療操作交叉?zhèn)鞑ザ鸹颊哚t(yī)院獲得性感染。開展醫(yī)務(wù)人員、易感患者鼻腔定植菌的篩查、干預(yù)措施的研究，不但有助于自身感染性疾病的預(yù)防和治療，而且對(duì)于醫(yī)院感染的防控具有重要意義。研究[17]證實(shí)，約三分之一的醫(yī)院感染都可直接或間接因醫(yī)務(wù)人員經(jīng)手傳播的細(xì)菌造成。手衛(wèi)生是預(yù)防和控制醫(yī)院感染最簡(jiǎn)單、有效、方便和經(jīng)濟(jì)的方法[18]，可顯著降低醫(yī)療機(jī)構(gòu)中肺炎克雷伯菌和MRSA的傳播，降低醫(yī)院感染發(fā)生[19]。結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果，我們對(duì)臨床醫(yī)學(xué)本科生也進(jìn)行了手衛(wèi)生等醫(yī)院感染控制措施的教育培訓(xùn)，有效地培養(yǎng)手衛(wèi)生習(xí)慣和對(duì)醫(yī)院感染防控的認(rèn)識(shí)。軍醫(yī)大學(xué)本科生作為軍隊(duì)和地方醫(yī)院醫(yī)務(wù)工作者的預(yù)備人才，樹立良好的醫(yī)療衛(wèi)生行為和感染控制意識(shí)對(duì)于醫(yī)院感染防控以及平戰(zhàn)時(shí)感染性疾病的防治具有戰(zhàn)略作用。