楊 冬 徐經(jīng)緯

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875）

2018年美國(guó)化學(xué)家Frances Arnold 獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其主要成就是在蛋白質(zhì)的定向演化（directed evolution）上作出了開拓性的貢獻(xiàn)。利用定向演化技術(shù)，科學(xué)家可提高酶的活性，改變酶的底物或產(chǎn)物范圍，提高酶在特殊環(huán)境下的穩(wěn)定性等，從而使酶在工業(yè)上有更廣泛的應(yīng)用潛力。不僅如此，定向演化實(shí)驗(yàn)還可以為研究蛋白質(zhì)在自然環(huán)境下的演化歷程提供數(shù)據(jù)，從而在進(jìn)化論的理論研究上作出貢獻(xiàn)。什么叫定向演化？ 它又有什么用途？

蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)的各個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用,同時(shí)，其作為生物催化劑或新型大分子藥物也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，通過改造蛋白質(zhì)分子以改進(jìn)其生物活性在工業(yè)上具有重要意義。這一技術(shù)稱為蛋白質(zhì)工程。由于蛋白質(zhì)的性質(zhì)是由其氨基酸序列所決定的，因此，通過改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就可能改變其特性，從而設(shè)計(jì)出具有新型特征的蛋白質(zhì)。然而，要成功改造一個(gè)蛋白質(zhì)，需知道應(yīng)在其氨基酸序列的哪些位點(diǎn)作出哪些改變。目前主要有2種策略。一種策略被稱為理性設(shè)計(jì)（rational design），即利用已知的該蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的信息，進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而改變?cè)摰鞍踪|(zhì)的特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)其的改造。但是，在這一領(lǐng)域中,最大的困難是目前還不能精確地建立蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系［1］。因此，對(duì)于大部分體系而言，理性設(shè)計(jì)的效率并不高。另一個(gè)策略則是進(jìn)行定向演化［1-2］。在這一思路下，研究者不需要針對(duì)蛋白質(zhì)的工作機(jī)理作出假設(shè)，而是利用進(jìn)化的原理，經(jīng)過多輪篩選，從突變文庫中選擇出具有所需特性的蛋白質(zhì)。

定向演化的整個(gè)過程可以總結(jié)如下（圖1）。首先需要建立一個(gè)突變文庫，然后表達(dá)出蛋白質(zhì)，并針對(duì)蛋白質(zhì)的特定功能對(duì)其進(jìn)行篩選，從而獲得符合要求的突變體進(jìn)入下一輪。通常，這些突變體帶有能表達(dá)出具有所需特性蛋白質(zhì)的突變基因。之后，在所獲得的突變體基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步突變，構(gòu)建新的突變文庫，再進(jìn)行下一輪篩選。這樣，經(jīng)過多輪選擇或篩選的過程，就有可能得到設(shè)計(jì)者所期望的最終產(chǎn)物。本文將以Arnold 的工作為例，介紹這幾年定向演化研究的具體成果。

圖1 定向演化的典型流程

1 改造枯草桿菌蛋白酶使之適應(yīng)二甲基甲酰胺（DMF）環(huán)境

酶在有機(jī)溶劑環(huán)境下，有時(shí)可以催化其在水相環(huán)境中無法催化的反應(yīng)。例如，絲氨酸蛋白酶在極性有機(jī)溶液環(huán)境下可以催化合成某些高分子化合物［3］。因此，通過改造酶的序列，增強(qiáng)其在某些有機(jī)溶劑中的催化能力，很可能具有工業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值。例如，可用于合成某些有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的手性化合物。

Arnold 的研究組之前已獲得了含有3位氨基酸替換的枯草桿菌蛋白酶突變體（3M）和含有4位氨基酸替換的突變體（4M），其在含有20%～40%的DMF 環(huán)境下較野生型具有更高的催化效率（即更高的kcat/Km值）（圖2）［3］。在定向演化實(shí)驗(yàn)中，研究人員利用易錯(cuò)PCR 技術(shù)在4M 基礎(chǔ)上引入了隨機(jī)突變，構(gòu)建突變文庫并轉(zhuǎn)化B.subtilis細(xì)胞，在含有酪蛋白和DMF 的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。由于枯草桿菌蛋白酶是分泌蛋白，并可催化酪蛋白的水解反應(yīng)，因此，其活性可通過觀察培養(yǎng)基上的暈圈進(jìn)行判斷。通過挑選具有最大暈圈的克隆，即可獲得本輪演化過程中的最佳突變體。然后對(duì)其再進(jìn)行突變，構(gòu)建突變文庫，轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行下一輪篩選。經(jīng)過幾輪這樣的篩選，最后就得到了能在高濃度DMF 環(huán)境下有效發(fā)揮催化作用的枯草桿菌蛋白酶突變體（PC3）［3］。

在40%的DMF 濃度下，PC3的催化效率是野生型的100倍以上，與4M 相比，也比其高2倍以上（圖2）。不僅如此，PC3還可在更高的DMF 濃度下發(fā)揮催化作用。在60%和85%的DMF 條件下，其催化效率分別達(dá)到野生型的256倍和131倍。由于當(dāng)初進(jìn)行這一定向演化實(shí)驗(yàn)的主要目的是為了利用絲氨酸蛋白酶在極性有機(jī)溶劑條件下合成高分子化合物的能力，研究人員還特別對(duì)此進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PC3在70%的DMF 條件下可催化合成約15mg 的多聚-L-甲硫氨酸，其聚合度達(dá)到4.7kD。而野生型蛋白質(zhì)只能在60%的DMF 條件下合成聚合度約1.0～1.5kD 的多聚-L-甲硫氨酸［3］。

圖2 枯草桿菌蛋白酶野生型蛋白質(zhì)和各個(gè)突變體水解底物sAAPF-pna 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（數(shù)據(jù)來自Chen，K［3］）

2 逆轉(zhuǎn)海因酶（hydantoinase）的對(duì)映體選擇性（enantioselectivity）

海因酶的作用是水解5′-單取代海因（5-monostubstituted hydantoin），將其轉(zhuǎn)變?yōu)镹-氨甲?；被幔∟-carbamoyl amino acid），而后者則可在L-氨甲酰水解酶（L-carbamoylase）的作用下轉(zhuǎn)變成氨基酸。所以海因酶在工業(yè)界可被用于氨基酸的合成。但是，5′-單取代海因有L-和D-2種對(duì)映體（圖3）［4］。在甲硫氨酸的合成過程中，海因酶偏好的底物是D-對(duì)映體，即D-5-（2-甲硫基乙基）-海因（D-MTEH），因此無法用于L-甲硫氨酸的合成。所以如果能將海因酶的底物選擇性轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-對(duì)映體，即L-5-（2-甲硫基乙基）-海因（LMTEH），則將有重要的工業(yè)意義。

圖3 5-單取代海因的L-、D-對(duì)映異構(gòu)體［4］

在這項(xiàng)工作中，研究者通過易錯(cuò)PCR 技術(shù)在海因酶的序列中引入隨機(jī)突變，構(gòu)建了突變文庫。之后將細(xì)胞培養(yǎng)在含有D-MTEH 或L-MTEH 的培養(yǎng)基上，并通過檢測(cè)pH 的變化跟蹤海因酶催化的反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變體的篩選。通過篩選了約10000個(gè)克隆，研究者發(fā)現(xiàn)了突變體19AG11和11DH7。使用手性HPLC 技術(shù)對(duì)這2個(gè)突變酶進(jìn)行研究表明，雖然它們還是偏向使用D-MTEH作為底物，但其對(duì)D-對(duì)映體的選擇性顯著變?nèi)酢Ｓ捎谶@2個(gè)突變體都包含有I95L 突變，研究者進(jìn)一步構(gòu)建了含有I95L/Q251R 突變的突變體11DH7，并在此基礎(chǔ)上引入了新的隨機(jī)突變進(jìn)行第2輪篩選，得到了22CG2。該突變體的對(duì)映體選擇性與11DH7相同，但是其活性有所提高［4］。

由于繼續(xù)使用易錯(cuò)PCR 技術(shù)似乎很難進(jìn)一步提高酶對(duì)L-MTEH 的選擇性，研究者打算另辟途徑。他們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)I95可能在對(duì)映體的選擇性上有重要作用，于是就在22CG2的基礎(chǔ)上，對(duì)第95位氨基酸進(jìn)行了飽和突變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一個(gè)突變體Q2H4（含有I95F）具有明顯的L-MTEH選擇性，且其活性在22CG2的基礎(chǔ)上還有進(jìn)一步提高［4］。在E.coli中構(gòu)建含有Q2H4的代謝通路后，經(jīng)過發(fā)酵可明顯觀察到L-甲硫氨酸的積累［4］。這一結(jié)果顯示了該突變體在氨基酸合成工業(yè)上的潛力。這項(xiàng)工作同時(shí)證明了先使用易錯(cuò)PCR 取樣序列空間進(jìn)行粗篩，找到關(guān)鍵氨基酸后，再利用飽和突變進(jìn)行更加精細(xì)的篩選，從而實(shí)現(xiàn)酶的定向演化這一思路的可行性。

3 通過定向演化改造類胡蘿卜素合成路線中的酶從而獲得新型產(chǎn)物

萜類化合物是一大類具有極大多樣性的天然產(chǎn)物，其構(gòu)成單元為異戊二烯。在生物合成過程中，細(xì)胞利用不同的反應(yīng)途徑先合成異戊二烯焦磷酸（isoprenyl pyrophosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）。然后通過聚合反應(yīng)，細(xì)胞可以合成包含有不同異戊二烯單元的線性分子，之后由不同的萜烯合成酶催化環(huán)化反應(yīng)，再經(jīng)過進(jìn)一步的修飾（如羥化等）從而生成各類最終的萜類產(chǎn)物。類胡蘿卜素屬于四萜類化合物，即它們均含有8個(gè)異戊二烯單元。所有的類胡蘿卜素的前體都是含有8個(gè)異戊二烯單元的八氫番茄紅素（phytonene）。在該化合物的基礎(chǔ)上，八氫番茄紅素去飽和酶（phytonene desaturase）可以引入2-6個(gè)碳-碳雙鍵（取決于該酶的物種來源），從而形成具有不同飽和程度的類胡蘿卜素產(chǎn)物（圖4）［5］。在通常情況下，八氫番茄紅素去飽和酶引入的雙鍵數(shù)量不超過5個(gè)。只有來源于E.uredovora的酶可以催化合成少量的完全共軛的3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素 （3，4，3′，4′-tetradehydrolycopene），即被引入6個(gè)雙鍵的產(chǎn)物［5］。

圖4 八氫番茄紅素去飽和酶催化從八氫番茄紅素脫氫產(chǎn)生不同的類胡蘿卜素產(chǎn)物

類胡蘿卜素具有抗氧化活性，因此，其在抗腫瘤或慢性疾病的治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在這項(xiàng)研究中，Arnold 的團(tuán)隊(duì)試圖探索通過改造類胡蘿卜素合成通路上的酶，從而合成新型的類胡蘿素的可能性［5］。在研究過程中，研究人員使用了DNA改組（DNA shuffling）技術(shù)，將來源于E.uredovora和E.herbicola的八氫番茄紅素去飽和酶進(jìn)行同源重組，從而獲得了可供篩選的突變文庫。之后，在E.coli中表達(dá)合成上游產(chǎn)物香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate） 和八氫番茄紅素的合成酶,以及這些八氫番茄紅素的去飽和酶突變體。由于類胡蘿卜素是有顏色的，因此可直接通過觀察克隆的顏色進(jìn)行篩選。通過篩選約10000個(gè)克隆，研究人員得到了突變體Ⅰ14［5］。Ⅰ14的顏色為粉色，說明其產(chǎn)物含有比番茄紅素（lycopene）更多的雙鍵。通過HPLC 最后鑒定該酶確實(shí)可催化3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素的合成。

在此基礎(chǔ)上，研究者又同樣使用DNA 改組技術(shù)，建立了番茄紅素環(huán)化酶的突變文庫。在表達(dá)香葉基香葉基焦磷酸和八氫番茄紅素的合成酶，以及八氫番茄紅素去飽和酶突變體Ⅰ14的E.coli細(xì)胞中，經(jīng)過篩選4500個(gè)克隆，最后發(fā)現(xiàn)了一個(gè)鮮紅色的克隆（Y2），其產(chǎn)物經(jīng)過HPLC 分析被鑒定為包含有紅酵母烯（torulene）［5］。該物質(zhì)是3，4，3′，4′-脫氫番茄紅素的前體3，4-脫氫番茄紅素（3，4-didehydrolycopene）的環(huán)化產(chǎn)物。此項(xiàng)研究在歷史上第1次鑒定出能通過直接環(huán)化3，4-脫氫番茄紅素從而合成紅酵母烯的酶［5］。

4 總結(jié)與展望

目前，通過定向演化技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造可提高或改變其活性。這項(xiàng)技術(shù)具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力，可以開發(fā)新型的酶用于化學(xué)合成工業(yè)，從而合成單純使用化學(xué)合成方法難以經(jīng)濟(jì)性地實(shí)現(xiàn)其合成的產(chǎn)物。

此外，定向演化技術(shù)所獲得的數(shù)據(jù)對(duì)于研究蛋白質(zhì)的分子演化也有一定的價(jià)值。例如，Arnold組在研究細(xì)胞色素P450蛋白時(shí)，通過定向演化將原先催化長(zhǎng)鏈脂肪酸羥化的P450BM3，改造成專一利用丙烷作為底物的P450PMOR2［6］。在這一定向演化實(shí)驗(yàn)中，研究人員進(jìn)行了多輪篩選。在分析每一輪篩選所選中的突變體（即演化中間體）的催化性質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)隨著演化的進(jìn)行，其中間體對(duì)于丙烷的kcat逐漸增大，Km逐漸減小［7］。但是，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性也隨著演化的進(jìn)程而逐步下降［7］。到突變體35E11時(shí)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性達(dá)到最低值［7］。而之后的突變體ETS8的熱穩(wěn)定性則明顯恢復(fù)，再之后的突變體19A12包含了一個(gè)重要的L188P 突變［7］。該突變本身對(duì)P450的穩(wěn)定性有很大的削弱，但是此突變對(duì)于酶的專一性轉(zhuǎn)向氣相烷烴（比如丙烷）起著決定性的作用［7］。從19A12開始，該P(yáng)450蛋白的最佳底物轉(zhuǎn)變成了短鏈烷烴，其長(zhǎng)度約3～4個(gè)碳原子，而之前的演化中間體則都有比較寬廣的底物范圍（包含3～9個(gè)碳原子的烷烴）［7］。

這一演化歷程中，那些改變酶的底物特異性或提高其催化效率的突變?cè)诖搜莼w系中被認(rèn)為是“有利”突變，是被選擇的對(duì)象。然而，這些突變往往對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有破壞作用。因此，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)演化到某個(gè)階段（即35E11）時(shí)，其穩(wěn)定性已非常低，乃至不可能再積累這些“有利”突變。而同時(shí)另一些突變對(duì)酶的催化則沒有直接影響，但是可提高酶的穩(wěn)定性。在野生型酶或比較早期的演化中間體中，這些突變屬于中性突變，因?yàn)榇藭r(shí)酶的穩(wěn)定性很高，再提高其穩(wěn)定性并不會(huì)使之具有選擇優(yōu)勢(shì)［2］。然而，當(dāng)演化到ETS8的時(shí)候，因?yàn)榫哂性黾拥鞍踪|(zhì)穩(wěn)定性突變基因的突變體可容納更多的“有利”突變，這將導(dǎo)致這些新一代的突變體能被選擇出來。所以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的突變可提高蛋白質(zhì)的可演化性（evolvability）［2］。在自然進(jìn)化過程中，這些提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的突變很可能是通過中性突變-隨機(jī)漂變的方式在蛋白質(zhì)中逐漸積累。因此，定向演化實(shí)驗(yàn)可能闡明在自然演化過程中中性突變對(duì)于蛋白質(zhì)演化的影響作用。