唐漫喬

作者單位：515834 廣東汕頭，汕頭市澄海區(qū)蓮下中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

2 型糖尿?。╰ype Ⅱ diabetes mellitus，T2DM）屬于多病因代謝疾病，主要是由胰島素缺乏或抵抗引起的代謝紊亂綜合征，且具有遺傳傾向［1］。糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）是血液中血紅蛋白（hemoglobin，Hb）與血糖（blood glucose，Glu）進(jìn)行非酶結(jié)合的產(chǎn)物，是T2DM 患者療效與預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)之一［2］。HbA1c 濃度不受葡萄糖每日波動(dòng)的影響，主要反映T2DM 患者過去6～8 周的Glu 濃度水平［3］。隨著醫(yī)學(xué)生物科技的發(fā)展，HbA1c 臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法越來(lái)越多，各實(shí)驗(yàn)室因所使用的儀器及配套試劑不同，每種檢測(cè)方法各有利弊，對(duì)同一份標(biāo)本在同一時(shí)間內(nèi)測(cè)定的HbA1c 濃度也存在較大差異［4-5］。本研究采用免疫比濁法（turbidimetric inhibition immuno assay，TIIA）和陽(yáng)離子交換層析法（ion-exchange chromatography，IEC）檢測(cè)HbA1c，分析兩種檢測(cè)方法的性能，評(píng)價(jià)TIIA 法和IEC 法檢測(cè)HbA1c 的應(yīng)用價(jià)值，以期提高HbA1c檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018 年1 月—2019 年2 月本院門診接收的T2DM 患者作為研究對(duì)象。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 診斷均符合2014 年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)糖尿病醫(yī)學(xué)診治標(biāo)準(zhǔn)［4］：①空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)PG）≥7.0 mmoL/L；② 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）2 h Glu≥11.1 mmol/L。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并酮癥；② 合并感染；③合并酸堿失衡；④ 合并電解質(zhì)平衡紊亂；⑤ 存在腎臟疾病或心臟病等器質(zhì)性疾病。

1.1.3 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：S2019-XX-029-01），對(duì)患者采取的治療和檢測(cè)得到過患者或家屬的知情同意。

1.2 儀器與試劑 IEC 法使用KH-101 型HbA1c全自動(dòng)檢測(cè)儀，儀器、試劑盒和校準(zhǔn)品均由深圳市凱特（Caretim）有限公司提供；TIIA 法使用日立7020 型全自動(dòng)生化分析儀，儀器、試劑盒和校準(zhǔn)品均由日本株式會(huì)社日立制作所提供；上述檢測(cè)詳細(xì)操作步驟均按說(shuō)明書操作。HbA1c 5.0%、15.0%質(zhì)控品由上海信帆有限公司提供（生產(chǎn)批號(hào)：181226）。

1.3 檢測(cè)方法 采集所有受檢者的空腹肘靜脈血10 mL，使用乙二胺四乙酸二鉀（Ethylenediaminete traacetic acid K2，EDTA-K2）抗凝，剔除明顯溶血或脂血標(biāo)本，置于超低溫-86 臥式醫(yī)用冰箱（浙江愛雪Iceshare 制冷電器有限公司提供）于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 IEC 法 采用IEC 法定量檢測(cè)HbA1c 濃度，其基質(zhì)由帶電荷的樹脂或纖維素組成，帶正電荷的稱為陰離子交換樹脂，而帶負(fù)電荷的稱為陽(yáng)離子樹脂。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)都處于不同等電點(diǎn)的pH 條件下，蛋白質(zhì)所帶電子情況均不同。帶陰離子電荷的蛋白質(zhì)能與陰離子交換基質(zhì)結(jié)合，因此這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，接著通過改變洗脫液的pH 或鹽離子強(qiáng)度等措施，將吸附在離子交換柱上的帶陰離子電荷的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，按結(jié)合由弱到強(qiáng)的順序?qū)⑾嚓P(guān)蛋白質(zhì)依次洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)，通過改變洗脫液的pH 或鹽離子強(qiáng)度將結(jié)合的帶陽(yáng)離子電荷的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度［6］。

1.3.2 TIIA 法 利用抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)定量檢測(cè)HbA1c 濃度，當(dāng)合適比例濃度的抗體與抗原在特殊稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)時(shí)，在稀釋系統(tǒng)促聚劑的作用下，可溶性免疫復(fù)合物自液相析出形成微小顆粒，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)抗體濃度固定在一定范圍之內(nèi)時(shí)，形成的免疫復(fù)合物量隨檢樣中抗原濃度的增加而增加，反應(yīng)液分光光度也隨之增加，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)抗原濃度［7］。

1.4 精密度試驗(yàn) 從所有T2DM 患者中隨機(jī)抽取30 份患者血液標(biāo)本混合為1 份（HbAlc 濃度為11.52%），分別采用IEC 法和TIIA 法同時(shí)連續(xù)檢測(cè)20 d，2 次/d，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV批內(nèi)）與批間變異系數(shù)（CV批間）。

1.5 線性相關(guān)分析 分別采用IEC 法和TIIA 法對(duì)所有T2DM 患者標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)HbAlc 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行直線函數(shù)回歸統(tǒng)計(jì)。設(shè)Y為IEC 法所測(cè)HbAlc 濃度水平，X為TIIA 法所測(cè)HbAlc 濃度水平。

1.6 回收試驗(yàn) 從所有T2DM 患者中隨機(jī)抽取9 份不同濃度血液標(biāo)本，HbAlc 濃度分別為20.14%、17.91%、15.61%、14.63%、11.52%、10.24%、9.29%、8.56%和5.64%，分別采用IEC 法和TIIA 法檢測(cè)回收率，每個(gè)濃度血液標(biāo)本檢測(cè)20 次。

1.7 相關(guān)保養(yǎng)維護(hù)和校準(zhǔn) 連續(xù)觀察兩臺(tái)儀器運(yùn)行狀態(tài)1 周，確保兩臺(tái)儀器運(yùn)行穩(wěn)定且狀態(tài)良好。培訓(xùn)相關(guān)操作者，操作者在熟悉儀器操作和各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)步驟后進(jìn)行各項(xiàng)相關(guān)性能評(píng)價(jià)，每次操作均帶有HbA1c 的標(biāo)準(zhǔn)品及HbA1c 的質(zhì)控物檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn) 協(xié) 會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A 文件要求［8］，兩種檢測(cè)方法在進(jìn)行線性相關(guān)分析時(shí)，直線函數(shù)回歸統(tǒng)計(jì)方法采用Linear Regression 線性回歸，計(jì)算回歸方程為Y＝aX+b，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 共納入168 例T2DM 患者。其中男性84 例，女性84 例；年齡32～74 歲，平均（47.8±8.9）歲。所有患者的性別、年齡等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。

2.2 精密度試驗(yàn) IEC 法在同一批次檢測(cè)中的CV批內(nèi)和CV批間均明顯優(yōu)于TIIA 法（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩種方法檢測(cè)HbA1c 的CV批內(nèi)與CV批間比較

2.3 線性相關(guān)分析 IEC 法測(cè)得的HbAlc 濃度水平與TIIA 法存在一元回歸直線方程關(guān)系，TIIA 法（X）與IEC 法（Y）存在較好的正相關(guān)直線性回歸關(guān)系。相關(guān)性分析回歸方程為Y＝0.97X+1.23Y，相關(guān)系數(shù)R2＝0.991。見圖1。

圖1 IEC 法與TIIA 法檢測(cè)HbAlc 濃度的回歸方程曲線

2.4 回收率試驗(yàn) IEC 法的平均回收率明顯優(yōu)于TIIA 法（P＜0.05）。見表2。

表2 兩種檢測(cè)方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果比較

3 討論

T2DM 是一種常見慢性疾病，因病程較長(zhǎng)，且大多數(shù)患者Glu 控制不太理想，常處于較高水平，容易導(dǎo)致人體代謝功能紊亂［9］，誘發(fā)靶器官（包括心腦血管、視網(wǎng)膜、神經(jīng)纖維和腎臟）并發(fā)癥及功能障礙等，嚴(yán)重影響患者身心健康和生活質(zhì)量［10］。HbAlc是Glu 與Hb 結(jié)合所形成的產(chǎn)物，HbAlc 合成速度與Glu 濃度呈正比，不受血糖暫時(shí)性升高的影響，不需要空腹，具有不可逆性、無(wú)需特定時(shí)間段抽取靜脈血和分析前不穩(wěn)定等特點(diǎn)，可真實(shí)有效地反映T2DM 患者一段時(shí)間內(nèi)（前120 d）Glu 控制情況，且不易受藥物、情緒、應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)和飲食等因素的影響［11］。雖然臨床上檢測(cè)HbAlc 的敏感性和特異性較好，但各生產(chǎn)廠商HbAlc 試劑盒質(zhì)量參差不齊，操作方法各異，使不同廠商在檢測(cè)HbAlc 時(shí)存在重復(fù)性差、準(zhǔn)確度不高等情況，導(dǎo)致HbAlc 的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大誤差，有時(shí)甚至容易誤診。為提高T2DM患者HbAlc 的檢測(cè)敏感性和特異性，近幾年臨床檢驗(yàn)工作者都在嘗試尋找敏感性和特異性更高、操作方式更便捷的HbAlc 檢測(cè)方法。

本研究結(jié)果表明，IEC 法的批內(nèi)和批間精密度、平均回收率均優(yōu)于TIIA 法。IEC 法和TIIA 法具有可比性和較好的相關(guān)性。IEC 法經(jīng)典的離子交換原理是利用各種蛋白質(zhì)分子在所設(shè)計(jì)檢測(cè)條件下攜帶電荷類型及電荷量不同，與離子交換劑結(jié)合的強(qiáng)度不同，可用不同檢測(cè)條件（離子強(qiáng)度、溫度、pH 值）洗脫出不同蛋白質(zhì)組分的一種層析法。IEC法使用KH-101 型全自動(dòng)HbA1c 分析儀，采用梯度洗脫組合技術(shù)，二元洗脫液無(wú)級(jí)連續(xù)變化，實(shí)現(xiàn)HbA1c 與HbA1ab 和HbA0 的完全分離。該儀器自動(dòng)化程度較高，僅需將抗凝全血置于儀器標(biāo)本架上，無(wú)需手工干預(yù)，即可自動(dòng)溶化細(xì)胞，混勻標(biāo)本、適當(dāng)稀釋標(biāo)本進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，使用指數(shù)模式的高斯對(duì)數(shù)（Gaussian logarithm，EMG），結(jié)合微積分?jǐn)M合計(jì)算出分析結(jié)果和分析圖譜，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線直接換算出HbA1c 檢測(cè)結(jié)果，全程計(jì)算機(jī)控制全自動(dòng)化完成，消除人為不熟練因素的影響［12］。TIIA 法使用單克隆或多克隆抗體直接測(cè)定Hb β 鏈糖基化N末端的4～8 個(gè)氨基酸，溶血?jiǎng)┲惺褂檬耐榛谆寤@為洗滌劑，因TIIA 法標(biāo)本需要預(yù)處理，手工溶血及稀釋后才能使用日立7020 型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，由于TIIA 法反應(yīng)中難免出現(xiàn)“HOOK”現(xiàn)象，即在進(jìn)行抗原與抗體的標(biāo)本測(cè)定時(shí)，待測(cè)標(biāo)本中的抗原物質(zhì)HbA1c 濃度升高至檢測(cè)限值的高濃度范圍，其測(cè)定的吸光度（A）值隨抗原物質(zhì)HbA1c濃度升高而開始下降，容易造成漏檢，必須將待測(cè)標(biāo)本重新稀釋至檢測(cè)上限濃度，才可以準(zhǔn)確檢測(cè)出抗原物質(zhì)HbA1c 濃度結(jié)果。TIIA 法受操作者因素影響大，操作繁瑣且受HbA1c 濃度范圍、溶血、脂血和黃疸等標(biāo)本因素影響，HbA1c 檢測(cè)結(jié)果存在重復(fù)性差、準(zhǔn)確度不高的情況［13］。

綜上所述，從方法學(xué)角度分析，IEC 法檢測(cè)全血HbAlc精密度優(yōu)于TIIA法，且與TIIA法相關(guān)性較好，同時(shí)IEC 法可動(dòng)態(tài)觀察T2DM 療效和監(jiān)測(cè)病情，具有準(zhǔn)確率高、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，適合臨床推廣使用。