周厚德，劉洋，游興勇，劉道峰，彭思露，劉成偉

(江西省疾病預(yù)防控制中心、江西省食源性疾病診斷溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330029)

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種可導(dǎo)致人、動(dòng)物共發(fā)病的革蘭陽(yáng)性短桿菌，該菌在自然界廣泛存在，對(duì)生存環(huán)境要求不高，能耐受較高的滲透壓和低溫，可污染食品冷藏、加工、運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)環(huán)節(jié)[1]。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌可污染肉類、海產(chǎn)品等，能引起人和動(dòng)物的嚴(yán)重感染，尤其是對(duì)免疫力低下人群(老人、懷孕婦女及新生兒)造成嚴(yán)重危害，是世界衛(wèi)生組織(WHO)90年代列舉的四大食源性病原菌之一[2]。為及時(shí)了解產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌在市售食品中的污染情況，2015-2017年對(duì)江西省選定的24個(gè)市縣的超市、百貨商場(chǎng)等流通環(huán)節(jié)銷售的12類食品(包括肉類、豆制品、速凍米面制品等)共采集4816份樣品進(jìn)行產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)血清凝集的方法進(jìn)行產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行分型步驟繁瑣、耗時(shí)，脈沖場(chǎng)凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分子分型方法具有分辨率高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已經(jīng)成為食源性疾病溯源的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。通過該方法對(duì)分離的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行分型，可對(duì)收集的陽(yáng)性菌株進(jìn)行分型歸類，為進(jìn)一步預(yù)防疾病發(fā)生奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在江西省24個(gè)市縣(宜春市、景德鎮(zhèn)市、萍鄉(xiāng)市、青山湖區(qū)、修水縣、青云譜區(qū)、吉州區(qū)、鉛山縣、奉新縣、彭澤縣、德安縣、興國(guó)縣、上饒縣、上栗縣、于都縣、安?？h、婺源縣、上高縣、樂安縣、德興市、豐城市、泰和縣、分宜縣、余江縣)的超市、百貨商場(chǎng)等市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)采集市售食品，包括肉類、海產(chǎn)品等。采樣時(shí)包裝完整、均在保質(zhì)期內(nèi)并且避免污染。

1.1.2 主要試劑 李斯特增菌肉湯LB(LB1、LB2)及配套試劑、鼠李糖和木糖生化管、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)均購(gòu)自青島海博公司，顯色培養(yǎng)基及配套試劑購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司?；|(zhì)和靶板均購(gòu)自比利時(shí)布魯克公司，限制性內(nèi)切酶AscI(英國(guó)NewEngland)，SeaKemGold(SKG)瓊脂糖(美國(guó) Cam-Brex)，蛋白酶K(美國(guó)Merck)，十二烷基肌氨酸鈉、Tris-Base、EDTA 和硼酸、Gel-red(美國(guó) Biotium)，H9812標(biāo)準(zhǔn)株 (由國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提供)。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 生物安全柜 (Biobase,中國(guó))， 恒溫培養(yǎng)箱 (EYELA LTI-1200,日本)，CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad。Vitek比濁儀(梅里埃,法國(guó))，基質(zhì)輔助飛行時(shí)間質(zhì)譜微生物鑒定儀(MIDLITOF)(布魯克,比利時(shí))。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與分離 產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢測(cè)依據(jù)國(guó)家食品污染和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)方法，無菌操作取樣25g(mL)加入到含有225 mL的LB1增菌液中，于30℃培養(yǎng)24h，然后取出0.1 mL轉(zhuǎn)種到10 mL的LB2培養(yǎng)液中，于30℃中培養(yǎng)24h后劃線接種李斯特菌顯色平板，培養(yǎng)24～48h后挑取顯色平板上呈現(xiàn)小圓形藍(lán)色菌落且周圍有白色暈圈的典型菌落接種普通平板，于36℃中培養(yǎng)24h。采用普通生化方法鼠李糖、木糖以及質(zhì)譜方法鑒定菌株，其中木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性且質(zhì)譜結(jié)果優(yōu)先顯示為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌并評(píng)分為1.8分左右的菌株鑒定為產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌。

1.2.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型 對(duì)確定的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型，將試驗(yàn)用菌株和H9812標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行包埋，用溶菌酶使細(xì)胞在膠塊中原位裂解，將包埋有菌體基因組的膠塊分別用超純水洗3次，再用TE清洗4次，洗滌后的膠塊用AscI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切后的樣品膠置于樣品梳上，從膠槽下部中央緩慢倒入100mL熔化的1%SKG。冷卻30 min后，拔去樣品梳，將膠塊放入電泳槽中，加入2.1L 0.5×TBE，進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳。電泳條件：AutoAlgorithm程序49 kb低分子量，450 kb高分子量，時(shí)間19h，電泳溫度14℃，其它條件選擇儀器默認(rèn)設(shè)置。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用0.1μg/mL的Gel-red染色30 min，置于純水中脫色30 min.PFGE指紋圖譜的聚類分析方法將試驗(yàn)獲取的的DNA圖譜用Bionumerics v7.6軟件進(jìn)行處理，識(shí)別圖形條帶。DNA圖譜以AscI酶切的H9812作為統(tǒng)一的分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)確定條帶位置。PFGE帶型之間的相似度采用Dice系數(shù)來衡量，用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行分析，最后輸出親緣關(guān)系樹狀圖譜[4]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel2007計(jì)算檢出率 ,使用SPSS18.0(SPSS Inc,美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Person卡方檢驗(yàn)(χ2)對(duì)不同產(chǎn)地和不同流通環(huán)節(jié)的檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同年份市售食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢出情況 2015年至2017年共采集樣品4816份，3年分別收集的樣品數(shù)為1716份、1799份和1301份，檢出產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的樣品分別為38份、18份和13份，陽(yáng)性率分別為2.21%、1.00%和0.99%，見表 1。

2.2 不同地區(qū)市售食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢出情況 2015年宜春市豐城市、南昌市青山湖區(qū)、景德鎮(zhèn)市、九江市德安縣檢出率相對(duì)較高，均高于均值的兩倍，其中宜春市豐城市檢出率最高，其余地區(qū)檢出率均小于均值的兩倍。2016年南昌市青山湖區(qū)、九江德安縣、九江修水縣、宜春市奉新縣檢出的陽(yáng)性率高于平均值，其它地方均低于均值或未檢出。2017年共有13個(gè)地市檢出陽(yáng)性樣品，檢出率均較低，其余地市均未檢出。各地區(qū)三年合計(jì)檢出情況存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (χ2=45.44,P=0.004)，見表2。

表1 2015-2017年市售食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢出情況

2.3 不同類別食品中單核增生李斯特氏菌檢出情況 2015-2017年24個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)共收集了12大類的食品，主要包括烘培食品、餐飲食品、蛋與蛋制品、豆制品、肉與肉制品、乳與乳制品、水產(chǎn)品等。各類樣品的檢出率不盡相同，豆制品、餐飲食品、冷凍食品、速凍米面制品、肉與肉制品等產(chǎn)品中均有檢出產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌。其中烘培類食品、餐飲食品、肉與肉制品等檢出率高于平均值；乳與乳制品、冷凍飲品、固體飲料等食品均未檢出該菌；蛋與蛋制品因檢測(cè)樣本較少，數(shù)據(jù)不具備參考性。不同類別樣品檢出產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=33.98,P＜0.001)，見表 3。

表2 2015-2017年不同地區(qū)市售食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢出情況

2.4 不同流通環(huán)節(jié)檢測(cè)結(jié)果 2015至2017年在24個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)對(duì)在不同流通環(huán)節(jié)進(jìn)行市售的食品進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，主要包括餐館、食堂、百貨商場(chǎng)、便利店、超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、網(wǎng)店、批發(fā)市場(chǎng)等，市售食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的檢出情況。各流通環(huán)節(jié)之間檢測(cè)情況存在顯著性差異(χ2=7.84,P=0.55)。見表4。

2.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳結(jié)果 對(duì)收集的69株陽(yáng)性分離株進(jìn)行PFGE分子分型，其中有14株菌因電泳過程中發(fā)生降解等原因未能成功獲得PFGE的完整條帶，其余菌株全部進(jìn)行了電泳，在電泳結(jié)果進(jìn)行DNA酶切圖譜聚類分析，條帶位置差異容許度選擇1.5%，優(yōu)化值選擇1%。根據(jù)條帶位置及數(shù)量的不同，只有三株菌為同一PFGE型別(定義相似值100%為同一PFGE型別)，其余菌株均各自為一個(gè)型別見圖1。

表3 2015-2017年12大類食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌檢出情況

表4 2015-2017年各流通環(huán)節(jié)市售食品產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的檢出情況

圖1 菌株P(guān)FGE聚類結(jié)果

3 討論

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌是一種細(xì)胞內(nèi)源性革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，該細(xì)菌具有較為強(qiáng)大的生存能力，能夠在較冷和高鹽的環(huán)境中生存，在食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售等多個(gè)環(huán)節(jié)均能夠產(chǎn)生污染，是WTO規(guī)定的4大食源性致病菌之一，該菌可引起人類腦膜炎、敗血癥、膿毒血癥等，表現(xiàn)為起病急、發(fā)熱(39℃以上)、意識(shí)障礙、昏迷以及小腦功能障礙等[5]。盡管目前我國(guó)還沒有產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌暴發(fā)感染的相關(guān)報(bào)道，但存在不少由該菌引起的散發(fā)病例報(bào)道[6]。產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌一旦引發(fā)感染，病死率高達(dá)30%～70%，病人即使幸免于難，也常常會(huì)留下共濟(jì)失調(diào)、失語(yǔ)、肢體癱瘓等后遺癥。2015-2017年對(duì)江西省25個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集了市售12大類食品進(jìn)行了產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的檢測(cè)，旨在研究該細(xì)菌在江西省市售食品中的分布和變化情況，更好的指導(dǎo)相關(guān)產(chǎn)品的市場(chǎng)管理。

三年市售食品的總檢出陽(yáng)性率為1.43%，存在一定程度的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的污染，有引起食物中毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)。2015年檢出率相對(duì)2016、2017年高一點(diǎn)，達(dá)到2.21%。不同類別采集的樣品比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=33.98,P＜0.001)，在2016、2017年均減少了肉與肉制品的采樣數(shù)量。三年來肉與肉制品的檢出率均較高，2015年2016年和2017年分別達(dá)到3.58%、1.57%和2.12%，均在當(dāng)年12大類食品中檢出率排在前列，2015年的總體檢出率相對(duì)高一點(diǎn)，可能與12大類樣品采集數(shù)量尤其是肉與肉制品等檢出率相對(duì)較高的食品類別采樣數(shù)量差異有一定的關(guān)系。不同監(jiān)測(cè)點(diǎn)之間檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.44,P=0.004)，南昌市、景德鎮(zhèn)市、九江市德安縣、宜春市豐城市、新余市分宜縣均相對(duì)其他地區(qū)有較高的檢出率，提示贛北地區(qū)尤其是南昌市周邊地區(qū)采集的樣品存在相對(duì)較高的風(fēng)險(xiǎn)，這可能與這兩個(gè)地區(qū)人口較多，市場(chǎng)流通量較大，各類樣品進(jìn)入市場(chǎng)有關(guān)，應(yīng)引起相應(yīng)的重視。本研究中50%的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分離自生畜肉、生禽肉和熟肉制品中，這與沈托[7]、周虓[5]等對(duì)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染調(diào)查結(jié)果一致。本次研究也表明江西省肉類食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染較為嚴(yán)重，存在較高的食品安全隱患，應(yīng)將肉類食品作為高危食品，在屠宰、加工、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格加強(qiáng)衛(wèi)生管理，這與江西省前期的研究較為一致[8]。通過對(duì)不同流通環(huán)節(jié)的結(jié)果分析表明，百貨商場(chǎng)、便利店可能存在較多的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染的產(chǎn)品，其中百貨商場(chǎng)的陽(yáng)性樣品率最高，可能與樣品數(shù)目較少有關(guān)，應(yīng)該加強(qiáng)這些場(chǎng)所食品安全的監(jiān)督和監(jiān)測(cè)，超市可能因?yàn)闃悠返臏?zhǔn)入門檻較高，雖然檢測(cè)量大，但污染樣品率低于平均水平，提示消費(fèi)者去超市購(gòu)買嬰幼兒食品是相對(duì)安全的行為。

PFGE方法作為國(guó)際通用的分子分型方法，為進(jìn)一步研究產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌的基因同源性及溯源提供了有效的支撐。盡管該方法分型過程存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、操作復(fù)雜、帶型之間比對(duì)困難等不足，但PFGE的優(yōu)勢(shì)在于能對(duì)所有的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌分離株進(jìn)行有效分型，使得該項(xiàng)技術(shù)成為目前產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌基因分型的最優(yōu)分型方法[3]。本文對(duì)調(diào)查分離的菌株采用PFGE方法分型發(fā)現(xiàn)只有三株菌存在100%一致，其余菌株均存在一定帶型差異，提示我省食品中分離的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌存在較高的基因差異。

江西地區(qū)市售食品仍然存在一定的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌污染風(fēng)險(xiǎn)，尤其是肉與肉制品等相關(guān)食品，相關(guān)部門應(yīng)該從原料、生產(chǎn)環(huán)節(jié)、環(huán)境、銷售等多個(gè)方面嚴(yán)格把關(guān)，提高監(jiān)測(cè)水平并加強(qiáng)相關(guān)菌株的分型與溯源水平，為提升人民健康水平提供強(qiáng)有力的保障。