賀素錦

(中國平煤神馬集團(tuán)職業(yè)病防治院 呼吸內(nèi)科，河南 平頂山467000)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的以氣道慢性炎癥為主要病理機(jī)制的呼吸道疾患，常表現(xiàn)為咳嗽、反復(fù)或持續(xù)性喘息、胸悶氣急，急性發(fā)作時(shí)可并發(fā)猝死、嚴(yán)重肺部感染、呼吸衰竭等[1，2]。 既往臨床研究顯示[3，4]，氣道慢性炎癥發(fā)生時(shí)使支配腎上腺髓質(zhì)的交感神經(jīng)興奮而釋放乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞(adrenM medullary chromafiin cells，AMCCs)的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)被激活，Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜上活化的鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進(jìn)去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)、多巴胺(dopamine，DA)、腎上腺素(adrenaline，Adr)釋放。Yu M 等[5]研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者腎上腺髓質(zhì)nAChRs構(gòu)成與健康對(duì)照組比較發(fā)生顯著性變化，他們推測(cè)哮喘患者nAChRs的 α3、α4、α7、β4 亞基構(gòu)成的變化可能與 AMCCs釋放Adr有密切關(guān)系。為進(jìn)一步證實(shí)Yu M等[5]的推測(cè)，本研究對(duì)172只小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)，旨在探討nAChRs對(duì)急性支氣管哮喘小鼠腎上腺激素分泌的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司 (許可證號(hào)：SO XK(滬)2007-0005)的7周齡健康SPF級(jí)C57B/L雄性小鼠172只，單只體質(zhì)量25～30g。小鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立通氣籠中，每籠5只，實(shí)驗(yàn)室室溫維持在25℃，濕度維持在50%，所有小鼠光照12h/d。采用同種無菌飼料對(duì)所有小鼠進(jìn)行投喂，飲水自由，術(shù)前禁食12h。采用隨機(jī)數(shù)字表法將172只小鼠分為哮喘組(n=86)與對(duì)照組(n=86)，兩組小鼠一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究上報(bào)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)及醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)并獲得批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 氫氧化鋁凝膠佐劑購于北京來福賽思科技有限公司；卵清白蛋白(OVA)購于上海斯信生物科技有限公司；ELISA試劑盒購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；雙蒸水購于上海喬羽生物科技有限公司；甲基牛扁堿購于上海起發(fā)實(shí)驗(yàn)試劑有限公司；免疫熒光染色試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司；碳酸鹽包被緩沖液購于美國Agdia公司；酶標(biāo)板購于上海晶安生物科技有限公司；Eppendorf移液槍購于北京卓信偉業(yè)科技有限公司；牛血清白蛋白購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；98%濃硫酸購于上海皖科電子科技有限公司；蘇木素購于北京酷來搏科技有限公司；1%鹽酸溶液購于上海銘博生物科技有限公司；伊紅購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；梯度酒精購于北京雅康博生物科技有限公司；中性樹膠購于成都麥卡?；び邢薰?；10%甲醛溶液購于杭州新喬生物科技有限公司；二甲苯購于上海瑞劍生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)指標(biāo) 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：哮喘組小鼠實(shí)驗(yàn)第0、7d腹腔注射200 ul含1 mg氫氧化鋁凝膠佐劑及10ug OVA的生理鹽水，第14、20d每日給予5%OVA霧化0.5h進(jìn)行激發(fā)以建立哮喘小鼠模型；對(duì)照組小鼠用生理鹽水替代進(jìn)行腹腔注射及霧化，其余同哮喘組。第2ld采用小鼠肺功能儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定兩組小鼠氣道反應(yīng)性，以生理鹽水激發(fā)的氣道阻力(airway resistance，AR)為基礎(chǔ)值，以不同濃度ACh激發(fā)的AR為激發(fā)值，激發(fā)值/基礎(chǔ)值評(píng)價(jià)小鼠氣道反應(yīng)性。采集兩組小鼠外周靜脈血 2ml，3000r/min離心10min，分離血清于-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)測(cè)定血清中OVA特異性的IgE抗體、Adr水平。取兩組小鼠右肺組織，用10%甲醛溶液固定，修剪，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋成塊，切成5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，流水沖洗，1%鹽酸溶液分化數(shù)秒，流水沖洗，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

體外實(shí)驗(yàn)：取兩組小鼠腎上腺分離及培養(yǎng)AMCCs，參照Franco A等[6]使用的免疫熒光及電子顯微鏡(美國Aspex公司)鑒定AMCCs。然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：①AMCCs培養(yǎng)2d后更換新鮮培養(yǎng)基，體積400μl，吹打均勻后取10μl沿蓋玻片邊緣滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后換成400μl雙蒸水到孔板中，-20℃和室溫反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞裂解液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞裂解液中Adr水平；②AMCCs培養(yǎng)2d后用不同濃度 (1、10、100、1 000、10000nmol/L)ACh 刺激 1min，收集細(xì)胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中Adr水平；③AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為10nmol/L的α7nAChR阻斷劑甲基牛扁堿 (methyllycaconitine，MLA)， 然后用 100 nmol/L的ACh刺激1min，收集細(xì)胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中Adr水平；④AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為30 μmol/L的α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987直接刺激1min，收集細(xì)胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中Adr水平；⑤AMCCs培養(yǎng)2d后換液，加入終濃度為10μmol/L的α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID，然后以100nmol/L的ACh刺激1min，收集細(xì)胞上清液于-20℃冰箱保存，采用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中Adr水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用spss22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果比較 ACh激發(fā)后哮喘組氣道反應(yīng)性顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。見圖1。

圖1 兩組小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定結(jié)果比較

2.2 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較 哮喘組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；哮喘組小鼠血清中Adr水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。見表1。

2.3 兩組小鼠HE染色結(jié)果比較 哮喘組小鼠支氣管壁及肺泡壁明顯增厚，支氣管及血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；對(duì)照組小鼠支氣管及血管周圍未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，見圖2。

表1 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較(，ug/l)

表1 兩組小鼠血清中OVA特異性的IgE抗體及Adr水平比較(，ug/l)

組別 造模數(shù)(只) IgE Adr哮喘組對(duì)照組Z/t P 86 86/ /10.71±3.88 0.21±0.21-7.968＜0.001 2.08±0.68 2.11±0.75 0.275 0.784

圖2 兩組小鼠HE染色結(jié)果×200(A：對(duì)照組；B：哮喘組)

2.4 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細(xì)胞裂解液中Adr水平比較 哮喘組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細(xì)胞裂解液中Adr水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。見表2。

2.5 兩組小鼠在不同濃度ACh刺激后AMCCs細(xì)胞上清液中Adr水平比較 不同濃度ACh刺激后，哮喘組小鼠AMCCs細(xì)胞上清液中Adr水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。見圖3。

表2 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細(xì)胞裂解液中Adr水平比較(，ug/l/1000 個(gè))

表2 兩組小鼠分離培養(yǎng)的AMCCs細(xì)胞裂解液中Adr水平比較(，ug/l/1000 個(gè))

組別 造模數(shù)（只） Adr哮喘組對(duì)照組t P 86 86/ /5501.12±793.09 7654.31±987.65 15.764＜0.001

圖3 兩組小鼠在不同濃度ACh刺激后AMCCs細(xì)胞上清液中Adr水平比較

2.6 α7nAChR阻斷劑MLA對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α7nAChR阻斷劑MLA后，在受到ACh刺激時(shí)哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。見圖4。

圖4 α7nAChR阻斷劑MLA對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

2.7 α7nAChR激動(dòng)劑 PUN-282987對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987直接刺激時(shí)哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05。 見圖5。

圖5 α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

2.8 α3β4-nAChR 阻斷劑 α-CTx TxID對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響 使用α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID后，在受到ACh刺激時(shí)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的能力均顯著下降，且哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。見圖6。

圖6 α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響

3 討論

引發(fā)哮喘的因素很多，呼吸道病毒感染、環(huán)境氣候改變、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)失常等可引起機(jī)體出現(xiàn)廣泛而多變的可逆性氣流受限從而引發(fā)持續(xù)性喘息，常在夜間和/或清晨加重，急性發(fā)作時(shí)可出現(xiàn)低氧血癥、多臟器衰竭甚至死亡，嚴(yán)重影響哮喘患者生命質(zhì)量。有研究顯示發(fā)生氣道重塑時(shí)，支配腎上腺髓質(zhì)交感神經(jīng)興奮而釋放ACh，促使AMCCs的nAChRs激活，Ca2+通道活化，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，繼而促進(jìn)Adr分泌。因此，探討nAChRs對(duì)急性支氣管哮喘小鼠Adr分泌的影響，可為支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制及防治靶點(diǎn)的研究提供新的方向。既往研究結(jié)果顯示，部分哮喘大鼠的AMCCs向神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致Adr合成減少。而Yu M等[5]發(fā)現(xiàn)哮喘患者血漿中Adr水平與健康對(duì)照者比較無顯著性差異，這一研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似。造成這種矛盾現(xiàn)象的機(jī)制尚未完全明確，我們推測(cè)在哮喘小鼠AMCCs合成Adr減少的情況下，可能有其它代償機(jī)制促進(jìn)AMCCs分泌Adr，最終維持哮喘發(fā)作時(shí)患者血漿中Adr水平無明顯波動(dòng)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[6]哮喘小鼠AMCCs的nAChRs中 α3、α4、α7、β4 亞基 mRNA 表達(dá)升高，但具體機(jī)制并未闡明。在神經(jīng)細(xì)胞中，ACh是在膽堿乙?；?choline acetylase，chAT)催化作用下合成的。有研究認(rèn)為[7]哮喘與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)被其相應(yīng)自身抗體損傷顯著相關(guān)。AChR包括毒蕈堿型受體(M受體)與煙堿型受體(N受體)，其中N受體為一類膽堿能受體，N1受體位于交感和副交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的突觸后膜，可引起神經(jīng)元興奮，N2受體位于骨骼肌終板膜，可引起骨骼肌興奮[8，9]。煙堿型受體又為離子通道型受體，其信號(hào)分子為神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與受體結(jié)合后通道蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，細(xì)胞膜離子通透性增強(qiáng)，離子通道開啟，使細(xì)胞外化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，進(jìn)而改變突觸后細(xì)胞興奮性[10，11]。除外，每個(gè)離子通道型受體由5個(gè)亞基組成，α1-10、β1-4、?等為已經(jīng)確認(rèn)的亞基，且不同亞基組成生理學(xué)特性不同的nAChR，由于α7nAChR通常形成亞基單一的同源五聚體，故在所有亞基中α7nAChR對(duì)Ca2+的通透性最高[12]。同時(shí)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠α7nAChR mRNA表達(dá)水平顯著高于 α3nAChR mRNA、α4nAChR mRNA、β4nAChR mRNA，由此我們推測(cè)在哮喘小鼠AMCCs合成Adr減少的情況下，α7nAChR可能代償促進(jìn)AMCCs分泌Adr，使哮喘患者血漿中Adr維持在正常水平。Wong D F等[13]建立動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠注射α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987后血清中Adr水平上升，注射α7nAChR阻斷劑MLA后血清中Adr水平降低。然而在本研究中，使用α7nAChR阻斷劑MLA或α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987后，哮喘小鼠在受到ACh刺激時(shí)AMCCs分泌Adr的能力與對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均不能促進(jìn)AMCCs釋放Adr。分析其原因可能是因?yàn)椋磉_(dá)α7nAChR的哮喘小鼠AMCCs缺乏苯乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phenylethanolamine Nmethyl transferase，PNMT)而不能合成Adr[14，15]。這一結(jié)果也較好地提示了以往實(shí)驗(yàn)中給予α7nAChR阻斷劑MLA或α7nAChR激動(dòng)劑PUN-282987所造成的哮喘小鼠血清中Adr水平變化可能為藥物的間接作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠AMCCs的α3nAChR mRNA、α4nAChR mRNA表達(dá)增高，并且考慮到α3nAChR mRNA特異性阻斷劑的可獲得性，本研究探討了α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID對(duì)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的影響，結(jié)果顯示使用α3β4-nAChR阻斷劑α-CTx TxID后，在受到ACh刺激時(shí)兩組小鼠AMCCs分泌Adr的能力均顯著下降，且哮喘組小鼠AMCCs分泌Adr的能力明顯低于對(duì)照組，提示α3β4-nAChR參與兩組小鼠 AMCCs分泌 Adr，且哮喘小鼠α3β4-nAChR表達(dá)明顯高于健康對(duì)照小鼠。我們推測(cè)α3β4-nAChR表達(dá)增加可能是對(duì)AMCCs分泌Adr減少的一種代償性反應(yīng)，以便機(jī)體在受到外界因素刺激時(shí)能更好地釋放Adr進(jìn)行應(yīng)激調(diào)節(jié)。

綜上，急性支氣管哮喘小鼠nAChRs亞基構(gòu)成的改變參與調(diào)控AMCCs分泌腎上腺素。由于本研究造模數(shù)較少，且研究時(shí)間短，還需擴(kuò)大樣本作進(jìn)一步研究。