王曉慧,羅湘軍,曾燕

(邵陽學院 1.藥學院；2.附屬第二醫(yī)院，湖南 邵陽，422000)

甲巰咪唑(thiamazole)為治療甲狀腺功能亢進癥的一線藥物，口服給藥常出現(xiàn)粒細胞減少，甚至出現(xiàn)肝功能損害。有研究表明甲巰咪唑口服給藥的血藥濃度雖然明顯高于經(jīng)皮給藥的血藥濃度，但甲狀腺組織中的藥物濃度無顯著性差異，提示經(jīng)皮給藥的全身不良反應小于口服給藥，與口服給藥相比，甲巰咪唑經(jīng)皮給藥具有起效快，全身不良反應小的特點[1]。近年來，脂質體作為藥物載體系統(tǒng)能減少藥物不良反應，并具有良好的治療靶向性、緩釋性得以迅速發(fā)展和廣泛應用[2]。本實驗通過應用逆向蒸發(fā)一超聲法制備甲巰咪唑脂質體[3]，卡波姆940加為基質，分別加入 2%桉葉油、2%薄荷、2%月桂醇氮酮為促滲劑，制備脂質體凝膠。通過離體大鼠腹皮結合改良 Franz 擴散裝置考察了不同促滲劑體外透皮特性運用，優(yōu)化后的脂質體凝膠與市場復方甲巰咪唑軟膏進行了體外透皮特性比較和評價，旨在為該藥物的制劑后期開發(fā)提供其在體內釋放過程規(guī)律的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本島津LC—2100C型高效液相色譜儀，島津工作站CLASS—VP 6.12版。Spect ra 100 紫外檢測器。AB204—N電子分析天平，真空干燥箱。旋轉蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器)。

1.2 試藥

甲巰咪唑對照品(上海金穗生物科技公司，≥99.0%);內標為鄰苯二酚(分析純，上海試劑總廠);甲醇(色譜純，天津四友醫(yī)學生物技術公司);磷脂(德國Nattermann公司，批號S180207);膽固醇(美國Sigma公司，批號0017065);卡波姆940(西安天正藥用輔料有限公司，批號20180423)；月桂醇氮酮(上海山浦化工有限公司，批號20160201);5%復方甲巰咪唑軟膏(山東齊魯制藥有限公司,批號1811002)。

1.3 動物

Wistar大鼠雌雄各半，體重(200±20) g，由邵陽學院實驗動物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 甲巰咪唑脂質體的制備

處方：磷脂0.25 mol、膽固醇0.1 mol分別加入甲巰咪唑0.01 mol，磷酸緩沖鹽溶液(pH 6.8)至100 mL，采用逆向蒸發(fā)一超聲法按文獻[3]制備以備用。

1.4.2 甲巰咪唑脂質體凝膠的制備

稱取2.0 g卡波姆940，均勻分散于96 mL蒸餾水中，充分濕潤后加入磷酸緩沖鹽溶液(pH 6.8)4 mL，充分攪拌，溶脹過夜，三乙醇胺調整 pH為6.0～6.8，得到凝膠基質。

甲巰咪唑脂質體與凝膠基質等量混合得到甲巰咪唑脂質體凝膠。

1.4.3 甲巰咪唑檢測的色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18 柱(150 mm ×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇∶水為17∶83；檢測波長：252 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL 。

1.4.4 標準曲線的制定方法

精密稱取甲巰咪唑標準品0.1 g至100 mL容量瓶中，加0.9%的氯化鈉至刻度，作為標準溶液備用。依次精密量取上液0.1、0.2 、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，均加入0.9%的氯化鈉溶液定容。按甲巰咪唑檢測的色譜條件分別進樣 20 μL，以峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸。

1.4.5 精密度實驗

分別精密量取甲巰咪唑標準品溶液0.1、0.6、2.5 mL至50 mL容量瓶中，加入0.9%的氯化鈉溶液定容，分別配成低、中、高質量濃度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巰咪唑生理鹽水溶液。

取低、中、高質量濃度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巰咪唑生理鹽水溶液，按甲巰咪唑檢測的色譜條件，1 d內重復進樣3次，每次進樣20 μL，測定甲巰咪唑濃度，計算日內相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。將上述樣品相同條件下5 d內連續(xù)每天進樣 20 μL，計算日間RSD。

1.4.6 回收率實驗

取低、中、高質量濃度(2.0、12.0、50.0 mg/L)的甲巰咪唑生理鹽水溶液，按照甲巰咪唑檢測的色譜條件，每個濃度重復測定3次，測得回收率。

1.4.7 甲巰咪唑脂質體凝膠中不同促滲劑對經(jīng)皮滲透的影響

1.4.7.1 制備含不同促滲劑的脂質體凝膠

取25 mL甲巰咪唑脂質體與凝膠基質25 mL混合均勻，加甘油0.2 g，月桂醇氮酮1.0 g，磷酸緩沖鹽溶液(pH 6.8) 4 mL，然后用三乙醇胺調節(jié)其 pH 值在 6.0～6.8，即制得甲巰咪唑含量為57 μg/mL的均勻、細膩黏稠狀乳白色脂質體凝膠，置于4 ℃保存。

1.4.7.2 含不同促滲劑的脂質體凝膠的藥物體外透皮釋放濃度的測定

取含不同促滲劑(桉葉油、薄荷、月桂醇氮酮，濃度均為2%)的脂質體凝膠，以不含促滲劑的甲巰咪唑水凝膠貼劑為對照，考察不同促滲劑對甲巰咪唑經(jīng)皮滲透的影響。按甲巰咪唑檢測的色譜條件測定相應的藥物濃度。

1.4.8 甲巰咪唑凝膠的體外透皮實驗

1.4.8.1 離體皮膚的制備

取雄性大鼠，斷頸處死，脫毛，去除皮下組織沖洗干凈，生理鹽水中浸泡30 min后，取出吸干，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆茫瑢嶒炃白匀唤鈨觥?/p>

1.4.8.2 體外透皮試驗

將處理好的鼠皮用夾子固定，置于水平擴散池的兩個半池之間，角質層面向給藥池，真皮面向接收池，擴散池有效滲透面積為2.80 cm2，接收池容積為 6 mL。改良Franz 擴散裝置加入7 mL 生理鹽水作為接收液，稱取甲巰咪唑脂質體凝膠、乳膏樣品各1 g分別均勻涂抹于大小相同的大鼠離體皮膚上，擴散池置于恒溫(37.0±0.5)℃水浴槽中，以磁力攪拌器持續(xù)攪拌，于0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h取出5.0 mL接收液，同時補足同體積的空白接收液。5.0 mL 接收液離心后的樣品上清液微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按甲巰咪唑檢測的色譜條件測定相應的藥物濃度Cn，按q=CV計算滲透量(q)，然后分別計算不同時間內的累積釋放率(Q)。

1.4.8.3 曲線擬合

將甲巰咪唑脂質體凝膠和復方甲巰咪唑軟膏的累積釋放率(Q)與時間(t)進行零級、一級、Higuchi用OriginPro 8.0軟件模擬擬合。

2 結果

2.1 標準曲線

按標準曲線制定方法測定，得線性方程：C=0.007 8A+0.623 5，r=0.999 4(n=8)。表明在10～90 mg/L范圍內藥物濃度與峰面積有良好的線性關系。見圖1。

1-甲巰咪唑 2-內標圖1 色譜圖Fig.1 Chromatogram

2.2 回收率實驗

按回收率試驗方法測定并計算回收率(n=3)，均值為101.18%。

2.3 精密度實驗

按精密度實驗方法測定并計算日內RSD均值(n=3)為1.18%；日間RSD均值(n=5)為1.53%。表明樣品穩(wěn)定性良好，本方法符合要求。

2.4 不同促滲劑對其經(jīng)皮滲透的影響

實驗結果表明，三種促滲劑對甲巰咪唑脂質體凝膠均有不同程度的促滲作用，尤以月桂醇氮酮最佳。故選用月桂醇氮酮作為促滲劑，濃度為2%，見圖2。

1-月桂醇氮酮 2-薄荷 3-桉葉油 4-空白圖2 不同促滲劑下甲巰咪唑脂質體凝膠的藥物滲透吸收比較Fig.2 Comparison of drug permeation and absorption of methimazole liposome gels with different permeation promoters

2.5 甲巰咪唑脂質體凝膠與復方甲巰咪唑軟膏的體外透皮性能比較

將相同含藥量的甲巰咪唑脂質體凝膠與市售復方甲巰咪唑軟膏的體外透皮性能進行了比較，結果見圖3 。

1-脂質體凝膠; 2-軟膏圖3 甲巰咪唑脂質體凝膠與復方甲巰咪唑軟膏經(jīng)皮滲透吸收比較Fig.3 Comparison of transdermal osmotic absorption of thimidazole liposome gel and compound thimidazole ointment

將甲巰咪唑脂質體凝膠和復方甲巰咪唑軟膏的累積釋放率(Q)與時間(t)進行零級、一級、Higuchi用OriginPro 8.0軟件模擬擬合，體外釋放擬合方程見表1。

表1 體外釋放擬合方程Table 1 In vitro release fitting equation

由圖3可知，甲巰咪唑脂質體凝膠和復方甲巰咪唑軟膏體外透皮吸收存在一定差異，擬合結果表明體外釋放過程均符合Higuchi方程。根據(jù)復方甲巰咪唑軟膏的藥物滲透曲線，可以看出用藥8 h達到釋放高峰，12 h內藥物累積滲透量略高于甲巰咪唑脂質體凝膠，隨之釋放快速停止；對于甲巰咪唑脂質體凝膠的藥物滲透曲線，用藥15 h達到釋放高峰，36 h仍有釋放(36 h后沒有繼續(xù)考察)，36 h藥物累積滲透量(82.01%)高于對照制劑復方甲巰咪唑軟膏(70.99%)，可長時間持續(xù)穩(wěn)態(tài)釋藥，具有緩釋的效果。

3 討論

甲巰咪唑為小分子親水性化合物，限于其理化性質，其乳膏和凝膠均難以吸收透過皮膚角質層。有研究發(fā)現(xiàn)磷脂是兩性分子，在水相中形成親水頭部向外、疏水部向內的囊泡結構[4]。有研究表明脂質體很容易包封脂溶性藥物，粒徑≤300 nm的脂質體能將活性藥物有效遞送到皮膚深層[5]。其選擇性高，靶向性強，具有減少藥物劑量、降低毒副作用、無免疫原性、緩慢釋放、降低體內消除速度、保護藥物提高穩(wěn)定性等特點[6]。本研究制備的脂質體，平均粒徑控制在170 nm 左右[3]。將甲巰咪唑包封于類脂質雙分子層形成的脂質體中間，體外釋放度及體外透皮實驗研究表明，甲巰咪唑脂質體凝膠劑具有良好的透皮效果，36 h釋藥平穩(wěn)，具有緩釋作用。

月桂醇氮酮是目前常用的藥物經(jīng)皮滲透促進劑，尤其是對親水性藥物具有較好的促滲透效果[7-8]。按上述方法分別制備的脂質體凝膠具有吸收速度快、生物利用度高、生物相容性良好、質地均勻、易于涂展和洗除、皮膚給藥不妨礙皮膚正常功能的特點。本實驗研制的甲巰咪唑脂質體凝膠，與軟膏比較，具有透皮吸收更好并可緩控的特點。但脂質體的靶向性、遠期穩(wěn)定性及凝膠的使用劑量控制仍有待進一步研究。