趙晉英，向思雨，劉鵬，曾明友

(邵陽(yáng)學(xué)院 1.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院;2.分子生物學(xué)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng)，422000)

血吸蟲病是一種廣泛流行的人獸共患寄生蟲病，在我國(guó)流行的主要是日本血吸蟲。血吸蟲生活史包括成蟲、蟲卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴及童蟲 6 個(gè)階段，尾蚴是日本血吸蟲的感染期幼蟲，人畜接觸了含有血吸蟲尾蚴的疫水，尾蚴就會(huì)通過(guò)皮膚很快鉆入體內(nèi)，寄生在宿主肝門靜脈-腸系膜靜脈系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、產(chǎn)卵，引起血吸蟲病[1]。尾蚴是血吸蟲的感染階段，也是其生命的薄弱環(huán)節(jié)，若能研制出針對(duì)尾蚴的疫苗和預(yù)防性殺蟲藥，直接從尾蚴階段進(jìn)行除蟲，將會(huì)是血吸蟲病防治中的重大突破[2]。因此開展血吸蟲尾蚴研究，建立通過(guò)染色法就能簡(jiǎn)單判別其生長(zhǎng)發(fā)育階段、微細(xì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成等信息是當(dāng)前需要迫切開展的一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作[3]。本研究用8種不同化學(xué)染色劑對(duì)日本血吸蟲尾蚴進(jìn)行染色，分析血吸蟲尾蚴的形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，探索血吸蟲尾蚴標(biāo)本理想的染色技術(shù)，為血吸蟲尾蚴研究提供參考，并為教學(xué)提供珍貴的永久性教學(xué)資源。

1 材料與方法

1.1 釘螺、試劑及主要儀器

陽(yáng)性釘螺(見圖1A)購(gòu)自江蘇省血吸蟲病防治研究所，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液和瑞氏-姬姆薩染色液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，尼氏(Nissl)染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，臺(tái)盼藍(lán)、剛果紅、茜素紅、考馬斯亮藍(lán)R250、麗春紅等化學(xué)染料均購(gòu)自北京索萊寶科技公司，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS-UVO.63XC)、圖像采集系統(tǒng)(CellSens standard)。

1.2 染色液的配制

1.2.1 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液

取0.4 g臺(tái)盼藍(lán)，用100 mL去離子水溶解。

1.2.2 0.1%茜素紅染液(pH 8.3)

取1 g Tris堿加入去離子水100 mL中，加HCL待pH為8.3即可，加入0.1 g的茜素紅溶解。

1.2.3 考馬斯亮藍(lán)R-250染液

取2.5 g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于227 mL甲醇中溶解，加46 mL冰醋酸，用蒸餾水補(bǔ)足至500 mL。

1.2.4 麗春紅染液

取2 g麗春紅和30 g 5-磺基水楊酸，加入30 mL三氯乙酸,去離子水定容到100 mL溶解。

1.2.5 剛果紅染色液

剛果紅0.5 g,甲醇80 mL,甘油20 mL，溶解。

1.3 方法

1.3.1 尾蚴獲取

取陽(yáng)性釘螺30個(gè)，放入100 mL燒杯中，加入50 mL殺菌去氯水，將燒杯置于光照充足的室溫下5 h，待血吸蟲尾蚴逸出水面后備用。

1.3.2 涂片、固定

用接種環(huán)蘸取疫水均勻涂布于潔凈的防脫載玻片中央，在顯微鏡下觀察尾蚴數(shù)量、存活狀態(tài)、蟲體狀態(tài)等，在酒精燈上稍加熱數(shù)秒(注意切勿將尾蚴烤干)，使尾蚴尾部伸直(見圖1B)，將玻片放置于玻片板上晾干。將晾干的玻片放置于4%甲醛溶液中固定30 min，取出后晾干備用。

A-肋殼釘螺(標(biāo)尺1.5 cm)；B-未染色尾蚴(×400，標(biāo)尺50 μm)圖1 尾蚴陽(yáng)性肋殼釘螺和未染色尾蚴Fig.1 Cercariae-positive ribbed-shell oncomelanias and unstained cercariae

1.3.3 染色

1.3.3.1 HE染色

涂片滴加蘇木精染液(Harris)染色5 min，水洗1 min，用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒。自來(lái)水沖洗后返藍(lán)15 min，然后水洗1 min。入伊紅染液染1 min，95%酒精分化5 s。

1.3.3.2 瑞氏-姬姆薩染色

按照試劑說(shuō)明書滴加A液0.5 mL于涂片上，染色1 min。再將B液滴加于A液上(滴加量為A液的3倍)，以洗耳球吹出微風(fēng)使液面產(chǎn)生漣漪狀，使兩液充分混合，染色3 min，水洗1 min。

1.3.3.3 Nissl染液染色

用移液槍吸取尼氏染液0.5 mL于涂片上，染色10 min，流水沖洗1 min。

1.3.3.4 臺(tái)盼藍(lán)染色

用移液槍吸取臺(tái)盼藍(lán)染液0.5 mL于涂片上，染色4 min，流水沖洗1 min。

1.3.3.5 考馬斯亮藍(lán)染色

用移液槍吸取考馬斯亮藍(lán)染液0.5 mL于涂片上，染色10 min，用鹽酸酒精分化數(shù)秒后，流水沖洗數(shù)秒。

1.3.3.6 麗春紅染色

用移液槍吸取麗春紅染液0.5 mL于涂片上，染色5 min，快速蒸餾水沖洗1 min。

1.3.3.7 茜素紅染色

用移液槍吸取茜素紅染液0.5 mL于涂片上，染色5 min,快速蒸餾水沖洗1 min。

1.3.3.8 剛果紅染液染色

用移液槍吸取剛果紅染液于涂片上，染色30 min,流水沖洗，堿性酒精分化數(shù)秒后流水沖洗1 min。

1.3.4 脫水、透明、封片

將尾蚴染色玻片依次放入70%、80%、90%、100%乙醇溶液中，每個(gè)梯度脫水3～5 min，將玻片放入二甲苯中透明2次，每次5 min。中性樹膠封片，待干。

1.3.5 鏡檢和測(cè)量

2 結(jié)果

2.1 尾蚴測(cè)量結(jié)果

尾蚴各部位長(zhǎng)度和寬度測(cè)量結(jié)果見表1。

表1 尾蚴各部位長(zhǎng)度和寬度測(cè)量Table 1 Length and width of each part of cercariae

2.2 HE染色

HE染色將尾蚴體尾部諸結(jié)構(gòu)顯示較為清楚，易于分辨。體部頭器、原腸、穿入腺、腹吸盤、生殖器原基、排泄囊等處含大量藍(lán)紫色致密顆粒，口器、腹吸盤藍(lán)紫色顆粒周圍呈顏色略深的均一紅色，其余部位紅色較淺。尾干皮下、中線染有大量規(guī)則排列分界清晰的藍(lán)紫色顆粒，尾叉部藍(lán)紫色顆粒略為雜亂，尾部其余部位呈著色均一的淺粉紅色。見圖2A。

2.3 瑞氏-姬姆薩染色

瑞氏-姬姆薩染色將尾蚴體部頭器、穿入腺、腹吸盤、排泄囊等部位染成深藍(lán)色斑塊，腸管染成藍(lán)色細(xì)線狀，體部其余部分呈均一深藍(lán)色。尾干外周皮下及尾叉處染有排列整齊的紫色顆粒，尾干中央為一團(tuán)排列不規(guī)則的藍(lán)色顆粒。見圖2B。

2.4 Nissl染色

尾蚴對(duì)Nissl染液染色呈不均一藍(lán)染。體部頭器、穿入腺(包括前鉆腺和后鉆腺)、腹吸盤、排泄囊等部位深藍(lán)色顆粒致密，其余部位藍(lán)色顆粒較為彌散，尾干中線兩側(cè)排列不規(guī)則藍(lán)色深染顆粒，尾部皮下染色顆粒整齊著色較淺，尾叉部分亦有少量藍(lán)染顆粒。見圖2C。

2.5 臺(tái)盼藍(lán)染色

臺(tái)盼藍(lán)能將尾蚴體部頭器、穿入腺、胚細(xì)胞、腹吸盤等部位染成深藍(lán)色斑塊，體部其余部位和尾部呈淺藍(lán)色顆粒，尾部中線兩側(cè)排列不規(guī)則藍(lán)色深染顆粒，尾部皮下顆粒較淺。見圖2D。

2.6 考馬斯亮藍(lán)染色

考馬斯亮藍(lán)將整只尾蚴染成基本均一的淡藍(lán)色，蟲體外周輪廓邊界清晰，體部染色較尾部深，體尾交界處染色略深，尾部隱約可見兩條藍(lán)色細(xì)線，推測(cè)可能為排泄管，但其余結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清。見圖2E。

2.7 麗春紅染色

麗春紅能將尾蚴體部腹吸盤、穿入腺等處染成較深紅色，體尾結(jié)合處染色較深，其余部位著色較淺且彌散。尾干及尾叉分布大量排列規(guī)則的紅色顆粒，尾叉分叉處顆粒較為密集。見圖2F。

2.8 茜素紅染色

茜素紅能將尾蚴體部頭器、腹吸盤、穿入腺、腸管等部位染成深粉紅色，穿入腺處著色最深，體部其余部位被染成均一粉紅色。尾干輪廓清楚，中線兩側(cè)排泄管染成粉紅色，其余部位著色不明顯。見圖2G。

2.9 剛果紅染液染色

剛果紅染液能將尾蚴頭器、腹吸盤、生殖器原基、排泄囊、腸管等處染成橘紅色，其余部位著色較淺。尾部染色較頭部略淺，尾干中線可見染成紅色的排泄管，其余部位著色不明顯。見圖2H。

A-HE染色；B-瑞氏-姬姆薩染色；C-Nissl染色；D-臺(tái)盼藍(lán)染色；E-考馬斯亮藍(lán)染色；F-麗春紅染色；G-茜素紅染色；H-剛果紅染色圖2 不同化學(xué)染料血吸蟲尾蚴染色結(jié)果(×400，標(biāo)尺50 μm)Fig.2 Staining results of Schistosoma cercariae with different chemical dyes

3 討論

血吸蟲尾蚴靜止時(shí)以腹部朝上、尾部向背部彎曲漂浮在水面,活動(dòng)時(shí)依靠尾部的擺動(dòng)作以尾部向前的倒退姿勢(shì)運(yùn)動(dòng)[4]。因尾蚴具有向光性，本實(shí)驗(yàn)采用燈源照射水中的釘螺，促進(jìn)尾蚴逸出，可獲取數(shù)量眾多的尾蚴。逸出的尾蚴集中于水面，故直接用接種環(huán)蘸取水膜涂在防脫載玻片上，在酒精燈上稍加熱數(shù)秒，促進(jìn)尾蚴尾部伸直，晾干后甲醛固定，經(jīng)后續(xù)染色、沖洗、脫水、透明等操作，尾蚴不脫片，形態(tài)結(jié)構(gòu)保存完整。

畢曉云等[5]通過(guò)砸碎釘螺獲取尾蚴，采用電子量微鏡研究后發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲尾蚴發(fā)育分為五期，第一期(S1)為胚細(xì)胞期,第二期(S2)為胚球期，第三期(S3)為尾蚴雛體期，第四期(S4)為成熟前期,第五期(S5)為成熟期。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自然逸出法獲取尾蚴，鏡下觀察活尾蚴的形態(tài)和活動(dòng)度，對(duì)染色尾蚴的體部、尾干、尾叉的長(zhǎng)度和寬度進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)尾部長(zhǎng)度大于體部長(zhǎng)度，從而確定獲取的尾蚴主要集中在成熟期階段，僅有極少量成熟前期尾蚴。

HE染色是組織學(xué)和病理學(xué)研究中最常用的染色方法，嗜堿性結(jié)構(gòu)可以被染成藍(lán)紫色，嗜酸性結(jié)構(gòu)被染成紅色。鮑沁露等[6]報(bào)道單獨(dú)使用0.5%伊紅，將死尾蚴染成淡紅色，頭器顏色相對(duì)較深，活尾蚴不能著色。本實(shí)驗(yàn)使用了蘇木精和伊紅兩種染液，相較于單一伊紅染色，HE染色能更清楚顯示尾蚴諸結(jié)構(gòu)。HE染色結(jié)果顯示尾蚴體部頭器、原腸、穿入腺、腹吸盤、生殖器原基、排泄囊等處含大量藍(lán)紫色致密顆粒，推測(cè)此處細(xì)胞核密集?？谄?、腹吸盤藍(lán)紫色顆粒周圍呈顏色略深的均一紅色胞漿，其余部位紅色較淺。尾干皮下、中線兩側(cè)染有大量規(guī)則排列分界清晰的藍(lán)紫色顆粒，屬于肌細(xì)胞和排泄管細(xì)胞的細(xì)胞核，這與畢曉云等[5]描述的一致。

瑞氏-姬姆薩染色是脫落細(xì)胞、血液和骨髓細(xì)胞染色中常采用的方法，可以將細(xì)胞核染成紫色，對(duì)胞漿著色力也較強(qiáng),能較好的顯示胞漿的嗜堿性程度[7]。本實(shí)驗(yàn)采用瑞氏-姬姆薩染液對(duì)尾蚴進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瑞氏-姬姆薩染液可將尾蚴體部頭器、穿入腺、腹吸盤、排泄囊等結(jié)構(gòu)染成深藍(lán)色斑塊，這與HE染色中蘇木精的著色相似，但體部其余部分呈均一深藍(lán)色。瑞氏-姬姆薩染液可將尾干外周皮下及尾叉處染成排列整齊的紫色顆粒，尾干中央為一團(tuán)排列不規(guī)則的藍(lán)色顆粒，這與HE染色結(jié)果相似，但染色整體效果及對(duì)比度不及HE染色法更形象和直觀。

Nissl染色是神經(jīng)組織染色中常用方法，染色液中的甲酚紫可將細(xì)胞核和神經(jīng)細(xì)胞中的尼氏體染成藍(lán)色[8]。本實(shí)驗(yàn)選用含有甲酚紫的Nissl染色液對(duì)尾蚴涂片進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體部頭器、穿入腺、腹吸盤、排泄囊等部位含大量深藍(lán)色顆粒，其余部位藍(lán)色顆粒較為彌散。這一結(jié)果與HE染色和瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果相似，說(shuō)明這些部位細(xì)胞密集。尾干中線兩側(cè)排列不規(guī)則藍(lán)色深染顆粒，皮下整齊排列淺染顆粒，尾叉部分亦有少量藍(lán)色顆粒。尾部結(jié)果與HE染色和瑞氏-姬姆薩染色結(jié)果略為不同，中線顆粒顏色強(qiáng)于皮下顆粒，推測(cè)中線兩側(cè)是神經(jīng)細(xì)胞集中區(qū)域。

臺(tái)盼藍(lán)是一種優(yōu)越的鑒別細(xì)胞活性的染料，本實(shí)驗(yàn)中用4%臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)5 min 染色后，不能使活尾蚴著色，但能將死尾蚴體部頭器、穿入腺、胚細(xì)胞、腹吸盤等部位染成深藍(lán)色，體部其余部位和尾部呈淺藍(lán)色，輪廓清晰，還可將尾部中線兩側(cè)染出排列不規(guī)則藍(lán)色深染顆粒，尾部皮下顆粒整齊淺染，這與本實(shí)驗(yàn)Nissl染色的結(jié)果相似。

考馬斯亮藍(lán)R-250和麗春紅均可與蛋白質(zhì)結(jié)合?？捡R斯亮藍(lán)可與蛋白質(zhì)結(jié)合顯現(xiàn)藍(lán)色[9]。麗春紅可以蛋白質(zhì)結(jié)合顯現(xiàn)紅色[10]。經(jīng)染色后尾蚴體部較尾部著色深，這說(shuō)明尾蚴體部的蛋白質(zhì)含量比尾部高。尤其腹吸盤、體尾交界處著色最深，推測(cè)這兩個(gè)部位蛋白含量較其他部位高。但兩種染料對(duì)尾蚴體部?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)均顯示欠佳。兩種染料對(duì)尾部的染色明顯不同，考馬斯亮藍(lán)可使尾部隱約可見兩條藍(lán)色細(xì)線，推測(cè)其為排泄管，但其余結(jié)構(gòu)辨認(rèn)不清。麗春紅能將尾干及尾叉染出大量排列規(guī)則的紅色顆粒，顆粒形態(tài)與HE和瑞氏-姬姆薩染色顆粒形態(tài)類似，推測(cè)可能屬于同一種結(jié)構(gòu)。

茜素紅能與碳酸鈣或磷酸鈣等鈣鹽螯合形成橙紅色復(fù)合物，適用于少量鈣鹽沉著組織的染色[11]。在本實(shí)驗(yàn)中茜素紅能將尾蚴體部頭器、腹吸盤、穿入腺等部位染成深粉紅色，其余部位被染成淺粉紅色，推測(cè)染色深的部位可能有更多鈣鹽沉積。尾干中線可見染成紅色的排泄管，其余部位著色不明顯。

剛果紅染色常用于組織切片中淀粉樣物質(zhì)的染色[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)剛果紅能將尾蚴頭器、腹吸盤、生殖器原基、排泄囊等處染成橘紅色，其余部位著色較淺。尾干皮下及中線兩側(cè)可見規(guī)律排列的橘紅色染色顆粒，與上述幾種染料顆粒形態(tài)相同。

總之，組織細(xì)胞的化學(xué)染色是使染料透入被染物,并被收留于其內(nèi)部的一種過(guò)程,此過(guò)程既有物理的吸附作用，又有化學(xué)結(jié)合作用，細(xì)胞的成份和化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)各種染料的親和力也不同[7]，因此在同一涂片可見不同的著色效果。本實(shí)驗(yàn)采用了8種不同的化學(xué)染料對(duì)尾蚴進(jìn)行染色，8種染色方法均能使尾蚴呈不同程度的著色，但在尾蚴形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示上有差異。本實(shí)驗(yàn)不同染料對(duì)尾蚴染色結(jié)果的差異性可能與染料與被染組分的特異性結(jié)合如酸堿化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，也可能存在非特異性結(jié)合。其中HE染色能將尾蚴各部位器官顯示清楚，對(duì)比明顯，可在教學(xué)科研中廣泛使用，其余染色方法著色組分各有特色，應(yīng)根據(jù)研究目的不同，選取不同的染色方法。