李明娟，李庚喜，朱琪

(邵陽(yáng)學(xué)院 藥學(xué)院,湖南 邵陽(yáng),422000)

果上葉(bulbophyllum odoratissimum，Lindl),別名羊奶果、極香石豆蘭、石串蓮，為蘭科植物云南石仙桃(pholidota yunnanensis，Rolfe)的干燥根狀莖和假鱗莖[1]。它是土家族、苗族的民間常用藥物，具有行氣止痛、潤(rùn)肺化痰的功效,用于治療多種炎癥效果較好，如肺結(jié)核咳嗽、咯血，慢性氣管炎，慢性咽炎，疝氣疼痛，月經(jīng)不調(diào)，瘡瘍腫痛等慢性炎癥[2]。對(duì)于果上葉的化學(xué)成分的研究目前較少，已有研究報(bào)道果上葉含有黃酮類化合物主要為白楊素(chrysin)和短葉松黃烷酮(pinobanksin)等[3]。其中白楊素在多種藥物中發(fā)揮了抗氧化、抗病毒的作用，該類化合物在植物中分布廣泛，毒性比較低，是近年來(lái)新藥開(kāi)發(fā)研究中一個(gè)非常重要的資源[4]。因此，對(duì)果上葉白楊素成分的分析，對(duì)研究果上葉的藥用部位和藥用價(jià)值具有指導(dǎo)意義，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)該藥物奠定基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外分析植物中白楊素成分的方法，主要為先提取分離，再采用紫外分光光度法、光譜方法和高效液相色譜法來(lái)定性和定量分析。高效液相色譜法用于成分分析，具有定量準(zhǔn)確，靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。本課題通過(guò)研究建立了高效液相色譜法測(cè)定果上葉中白楊素含量的方法，為果上葉質(zhì)量控制方法的建立提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥

Waters2695高效液相色譜儀，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器；萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius 公司)；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；銳思捷超純水機(jī)Unique系列(南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司)；超聲波清洗器KQ3200B型(昆山市超聲儀器公司)；白楊素對(duì)照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)ZL20150815N);甲醇為色譜純由天津科密歐化學(xué)試劑公司提供，其它試劑為分析純；液相用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

為確定白楊素標(biāo)準(zhǔn)品的最佳吸收波長(zhǎng)掃描，應(yīng)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)白楊素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)其在220 nm 波長(zhǎng)處具有最大吸收，因此，高效液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)選定為220 nm。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：以Agilent Eclipse XDB-C 18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(30∶70)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為室溫30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下獲得對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液的色譜圖如圖1、2、3所示。

圖1 白楊素對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of chrysin substance standard

圖2 民族藥果上葉供試品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of test sample with Bulbophyllum odoratissimum

圖3 陰性樣品溶液高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of negative sample

1.2.3 溶液的制備

精密稱取五氧化二磷干燥至恒重的白楊素對(duì)照品5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，加水至刻度，搖勻，制得對(duì)照品貯備液，精密量取貯備液1 mL置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

稱取果上葉干燥粉末200 g，按照料液比 1∶30 加入60%的乙醇，于 60 ℃加熱回流提取2 h，提取2次，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，得浸膏，用水分散后，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇采用索式萃取器分別提取，取正丁醇部分經(jīng)硅膠柱色譜分離、乙酸乙酯-丙酮梯度洗脫，洗脫液再進(jìn)行硅膠柱純化，以乙酸乙酯-正丁醇-甲醇(2∶2∶1)為洗脫劑，得供試品溶液，旋干得供試品。以甲醇為溶劑，將供試品配制為1 mg/mL的溶液，取供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-丁酮(9.4∶0.3∶0.3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘缸中檢視，兩者在相應(yīng)位置出現(xiàn)相同顏色斑點(diǎn)[7-8]，可確認(rèn)該供試品為白楊素[9]。供試品溶液用 0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)后，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，其色譜見(jiàn)圖1。

1.2.4 線性與范圍

按照1.2.3項(xiàng)下制得的對(duì)照品貯備液，精密量取1.00、2.00、4.00、8.00、10.00 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。依照上述高效液相色譜法條件記錄峰面積，各進(jìn)樣10 μL。以白楊素對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性分析，得回歸方程Y=968 758X+1 521，r=0.998 9。

1.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精取白楊素對(duì)照品溶液，重復(fù)3 d進(jìn)樣，每日重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，以測(cè)定其日內(nèi)精密度和日間精密度。計(jì)算待測(cè)峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精取同一供試品溶液，在配制后室溫放置0、2、4、6、12、24 h分別進(jìn)樣1次，計(jì)算峰面積RSD。

1.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同批樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液 6 份，分別按上述的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣,每份平行測(cè)定兩次，并計(jì)算各份的白楊素含量，其RSD為1.68%，重現(xiàn)性良好。說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

1.2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)的民族藥果上葉樣品，含量為0.039 2%，按上述1.2.3方法制備供試品溶液按上述色譜條件分離、測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.9 樣品的含量測(cè)定及結(jié)果

取不同批次的5批民族藥果上葉，每批稱取1.0 g各3份，精密稱定，按上述1.2.3方法制備供試品溶液并測(cè)定白楊素含量。

2 結(jié)果

線性回歸分析結(jié)果顯示，白楊素在測(cè)定濃度為10～100 μg/mL的范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD為1.12%，日間精密度RSD為2.09%，說(shuō)明儀器的精密度良好。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，峰值面積RSD為1.25%，說(shuō)明樣品溶液的穩(wěn)定性良好?；厥章蕦?shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，該方法回收率良好，準(zhǔn)確率較高，可行性較好。5批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Samping recouery test results(n=6)

表2 5批樣品含量測(cè)定的結(jié)果Table 2 Results of content determination in five test samples

3 討論

白楊素系黃酮類化合物，是新藥開(kāi)發(fā)研究中一個(gè)非常重要的資源。但目前，對(duì)果上葉黃酮類化合物的分離幾乎未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，并由于果上葉白楊素的含量低的原因，要對(duì)白楊素分離、純化比較困難，本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，分離條件的探索[10],最終發(fā)現(xiàn)，首先經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取黃酮類有效成分、硅膠柱初步純化分離和高效液相色譜的進(jìn)一步分離方法，對(duì)白楊素單體化合物的分析具有可行性。在分離條件探索中，曾對(duì)流動(dòng)相比例乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比列進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)[10-11]，發(fā)現(xiàn)乙腈所占比列低于20%時(shí)，白楊素與雜質(zhì)峰的分離較好，但白楊素的保留時(shí)間較長(zhǎng)，所以綜合考慮，調(diào)整流動(dòng)相的比例，其中乙腈-0.1%磷酸水溶液以30∶70的混合比例，其保留時(shí)間和各雜質(zhì)峰的分離度滿足要求，出峰時(shí)間亦相對(duì)較為合適，故將調(diào)整過(guò)后的流動(dòng)相列入分離條件。并經(jīng)過(guò)一系列的方法學(xué)考察，證明該方法操作方便，分離效果好、精密度和重現(xiàn)性高，穩(wěn)定性好；測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能為果上葉白楊素的質(zhì)量研究提供參考依據(jù)，同時(shí)也為果上葉中其他黃酮類化合物的分離與分析提供參考。果上葉制劑如巖果止咳蜜制劑的質(zhì)量控制方法亦未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，可進(jìn)一步作為其有效成分研究分析的依據(jù)。

本研究建立了果上葉白楊素的含量測(cè)定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，可用于果上葉的白楊素質(zhì)量控制方法的建立提供參考依據(jù) 。