滕曉宇， 李建勛， 胡雪艷， 龐國(guó)芳， 范春林,*

(1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院， 北京 100048； 2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院， 北京 100176)

三唑類(lèi)農(nóng)藥應(yīng)用廣泛，大多數(shù)屬于中低毒性農(nóng)藥，但其廣譜程度高、持效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)[1]，有引起慢性中毒的風(fēng)險(xiǎn)[2]。

茶葉的生產(chǎn)和使用在我國(guó)具有悠久的歷史，其食用方式多為直接沖泡，缺少一般食物烹飪的持續(xù)高溫等步驟，這樣也會(huì)造成茶葉中農(nóng)藥殘留無(wú)法有效揮發(fā)或降解失活[3]。歐盟和日本針對(duì)農(nóng)藥殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)苛[4]，文章所涉及的13種三唑類(lèi)農(nóng)藥在歐盟MRL(最高殘留量)標(biāo)準(zhǔn)中均有其在茶葉中的嚴(yán)格規(guī)定。建立準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法不僅可以為國(guó)民身體健康提供技術(shù)保障，也有利于突破國(guó)際貿(mào)易壁壘。在農(nóng)藥殘留的前處理技術(shù)中，主要有液液萃取、固相萃取和加速溶劑萃取等方法[4-5]，其中固相萃取由于具有優(yōu)異的去除雜質(zhì)的效果和良好的重復(fù)性得到了廣泛的應(yīng)用，如我國(guó)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23204—2008[5]中使用了Cleanert TPT固相萃取柱進(jìn)行凈化。該方法具有凈化效果好、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，但有機(jī)溶劑用量較大。因此，文章旨在建立一種達(dá)到歐盟MRL標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)要求的茶葉中13種三唑類(lèi)農(nóng)藥的分散固相前處理和檢測(cè)方法[6-9]，為將來(lái)開(kāi)發(fā)更靈敏、環(huán)保的農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品，宏德遠(yuǎn)利市場(chǎng)?？肪颉h(huán)丙唑醇、烯唑醇、氟硅唑、粉唑醇、己唑醇、葉菌唑、多效唑、戊菌唑、戊唑醇、四氟醚唑、三唑酮、三環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于95%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(40～60 μm)、石墨化炭黑(GCB)吸附劑(120～400 mesh)、多壁碳納米(Cleaner NANO-carb)(10～20 nm)，天津Bonna-Agela公司；乙腈、正己烷，色譜純，美國(guó)Thermo公司；醋酸，分析純，北京化學(xué)試劑公司；尼龍66濾膜，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A- 7200型氣相色譜- 四極桿- 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；SR- 2DS型水平振蕩器，日本Taitec公司；X- 30R型落地式冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司；N- EVAP112型氮吹儀，美國(guó)OA- SYS公司；R- 215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；TM- 1FN型渦旋混勻器，日本Asone公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg(精確至0.01 mg)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品分別于10 mL容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，靜置過(guò)夜后于25 mL容量瓶配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2樣品前處理

茶葉樣品粉碎后過(guò)16目篩取得粉末。稱(chēng)取5.0 g粉末于50 mL帶蓋聚丙烯離心管中，加入10.0 mL體積分?jǐn)?shù)1%醋酸乙腈均質(zhì)提取1 min，以1×104r/min離心5 min，取5 mL上清液于另一個(gè)裝有45 mg NANO- carb、75 mg PSA、25 mg GCB吸附劑的15 mL離心管中，以約2 200 r/min渦旋1 min混勻，以1×104r/min離心3 min。移取4 mL上清液至80 mL雞心瓶中，在40 ℃旋蒸至約0.5 mL，氮吹至近干，0.5 mL正己烷定容，過(guò)膜用于氣相色譜- 四極桿- 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀分析。

1.3.3色譜條件

色譜柱：VF- 1701 ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫條件：初始柱溫為80 ℃，以40 ℃/min升溫至220 ℃，再以8 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

1.3.4質(zhì)譜條件

電子轟擊(EI)離子源。電子能量為70 eV，燈絲電流為50 μA，離子源溫度為230 ℃，掃描模式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍(m/z)為50～600 u，采集速率為2 spec/s，溶劑延遲時(shí)間為6 min。

1.3.5精確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

在全掃描模式下采集，建立13種農(nóng)藥的個(gè)人化合物數(shù)據(jù)庫(kù)及譜庫(kù)(personal compound database and library，PCDL)，定性、定量離子具體信息見(jiàn)表1。

表1 13種農(nóng)藥的名稱(chēng)、CAS號(hào)、化學(xué)式及質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Compound names, CAS numbers, formula and mass references of 13 pesticides

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用儀器自帶軟件Mass Hunter B.07進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

為了提高分離效率，縮短檢測(cè)時(shí)間，對(duì)氣相色譜升溫程序進(jìn)行優(yōu)化，使13種農(nóng)藥的出峰時(shí)間介于7.1～12.2 min。

13種農(nóng)藥的總離子流色譜見(jiàn)圖1，與PCDL庫(kù)對(duì)比定性，按照序號(hào)從小到大依次為三唑酮、四氟醚唑、戊菌唑、己唑醇、多效唑、粉唑醇、氟硅唑、烯唑醇、環(huán)丙唑醇、三環(huán)唑、戊唑醇、糠菌唑、葉菌唑。其中12號(hào)的糠菌唑經(jīng)質(zhì)譜圖鏡像對(duì)比確證為雙峰。

2.2 提取方式優(yōu)化

參考綜述文獻(xiàn)中所用的提取方法[3]，采取渦旋、振蕩、均質(zhì)、超聲4種方式進(jìn)行提取。但在本實(shí)驗(yàn)中渦旋方式無(wú)法使茶葉中殘留農(nóng)藥獲得有效的回收率，這可能是茶葉粉末質(zhì)地緊密、細(xì)致，提取能量不足以使提取液充分滲透溶解基質(zhì)中的農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的，故棄去渦旋提取的方法，其余提取方法具體為：1)均質(zhì)提取，以1.4×104r/min提取1 min，每個(gè)樣品均質(zhì)后分別用水和乙腈3次清洗刀頭。2)超聲提取，室溫下樣品置于超聲清洗機(jī)中水浴，分別提取1、3、5 min。3)震蕩提取，室溫下樣品置于水平震蕩機(jī)，震蕩速度150 r/min，分別提取5、10、30 min。

*表示干擾離子。圖1 13種農(nóng)藥的總離子流色譜Fig.1 Total ion chromatogram of 13 pesticides

所有提取方式的回收率均在71%～102%，農(nóng)藥回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)除震蕩30 min提取的三唑酮以外，其余提取方式均小于20%(見(jiàn)表2)。

表2 不同提取條件下13種農(nóng)藥的回收率Tab.2 Recoveries of 13 pesticides under different extract conditions %

n=5。

超聲5 min提取效果最好，平均回收率為90.1%；均質(zhì)1 min，震蕩10、30 min、超聲3 min的提取效果比較接近，效果也比較好，平均回收率在87%～88%左右；其余2種略差為81%左右。綜合考量提取效果、時(shí)間、操作簡(jiǎn)便程度等方面，最終選取均質(zhì)1 min作為前處理提取方法。

2.3 凈化填料的配比選擇

Hayward等[10]進(jìn)行了含戊唑醇在內(nèi)的227種農(nóng)藥在紅、綠、白、烏龍茶中的添加回收驗(yàn)證，使用加入不同比例的PSA與GCB的ECPSA固相萃取柱和TPT固相萃取柱以及加入了PSA與carbon X Plus的COA固相萃取柱進(jìn)行凈化，經(jīng)氣相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)比統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：3種固相萃取柱中，含有500 mg PSA和500 mg GCB的TPT固相萃取柱較其余2種表現(xiàn)出更好的凈化回收效果。Hou等[11]在分散固相萃取的過(guò)程中，使用NANO- carb和PSA等凈化材料，建立了茶葉中含三唑酮在內(nèi)的78種農(nóng)藥殘留的氣相色譜- 三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜分析方法，研究中通過(guò)對(duì)NANO- carb和PSA的配比優(yōu)化，提高了共提物的凈化作用，獲得了良好的線性范圍和檢出限。王學(xué)翠等[12]利用高效液相色譜法對(duì)牛奶中6種四環(huán)素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：多壁碳納米管基質(zhì)固相分散萃取牛奶中四環(huán)素的回收率優(yōu)于C18,可推廣應(yīng)用到食品等復(fù)雜樣品中其他農(nóng)獸藥的殘留分析。

本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)凈化填料使用了常用來(lái)去除有機(jī)酸、金屬離子、酚類(lèi)、蠟質(zhì)和色素的PSA和GCB[13-14]填料，還使用了近十年來(lái)使用頻率越來(lái)越高的新型凈化材料—多壁碳納米管[15-17]，這種納米材料的多層平行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)質(zhì)的吸附性和穩(wěn)定性[18]。參考上述文獻(xiàn)中的凈化方法和用量，在均質(zhì)提取方法下，將得到的提取液分別采用3種凈化填料(NANO- carb、PSA、GCB)的6種配比方案進(jìn)行凈化(精確到0.5 mg)。具體凈化填料方案為：1)75 mg NANO- carb、125 mg PSA、25 mg GCB；2)75 mg NANO- carb、125 mg PSA；3)45 mg NANO- carb、75 mg PSA、25 mg GCB；4)45 mg NANO- carb、75 mg PSA；5)100 mg NANO- carb、150 mg PSA、25 mg GCB；6)100 mg NANO- carb、150 mg PSA。

6種不同配比的凈化填料方案對(duì)于13種農(nóng)藥的回收率見(jiàn)圖2，各方案RSD均在20%以?xún)?nèi)。從圖2中可以看出，在方案3的凈化條件下，13種農(nóng)藥的回收率均在80%～105%，波動(dòng)較小，總體回收率情況較為優(yōu)異。此外，在方案4條件下大多數(shù)農(nóng)藥的回收率效果也較好，而且沒(méi)有使用GCB，節(jié)省了填料；但是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，該方案凈化后的提取溶液較方案3顯示出較深的橘黃色，容易造成離子源的污染。綜上，選擇方案3作為優(yōu)化的凈化填料配比。

圖2 不同凈化填料配比下13種農(nóng)藥的回收率Fig.2 Recoveries of 13 pesticides on different conditions of purification fillers

2.4 檢出限、定量限和線性范圍分析

使用空白樣品的綠茶和普洱茶(熟)可以代表未發(fā)酵茶和發(fā)酵茶。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋配制成9個(gè)質(zhì)量濃度梯度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加驗(yàn)證。線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)見(jiàn)表3和表4。在2～1 000 μg/kg的線性范圍內(nèi)，綠茶和普洱茶基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，2種基質(zhì)的相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.995以上。

測(cè)定5份平行樣品，以信噪比(RSN)不低于3計(jì)算檢出限，RSN不低于10計(jì)算定量限。在2種基質(zhì)中，13種農(nóng)藥的檢出限在1～20 μg/kg，定量限在2～50 μg/kg，各自均滿(mǎn)足歐盟MRL要求[19]。

2.5 添加回收驗(yàn)證分析

進(jìn)行添加驗(yàn)證的質(zhì)量濃度為10、50、100 μg/kg。經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，回收率在72%～110%，R2均大于0.995。2種茶葉中13種農(nóng)藥的添加回收驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表3 綠茶基質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Matrix methodology results of green tea μg/kg

表4 普洱茶基質(zhì)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果Tab.4 Matrix methodology results of Puer tea μg/kg

表5 綠茶基質(zhì)添加回收驗(yàn)證結(jié)果Tab.5 Recovery experiment results of green tea matrix

n=5。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法為檢測(cè)100 μg/kg農(nóng)藥添加量在茶葉與溶劑中的響應(yīng)值，兩者差值與后者的比值乘以100%作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖3。數(shù)值為正數(shù)表示基質(zhì)增強(qiáng)作用，負(fù)數(shù)表示減弱作用，±20%以?xún)?nèi)表示弱基質(zhì)效應(yīng)，反之為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。從圖3中

表6 普洱茶基質(zhì)添加回收驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 Recovery experiment results of Puer tea matrix

n=5。

圖3 綠茶和普洱茶的基質(zhì)效應(yīng)Fig.3 Matrix effect of green tea and Puer tea

可以看出絕大多數(shù)農(nóng)藥在2種茶葉中呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)作用，這可能是由于茶葉中的一些成分與檢測(cè)系統(tǒng)的活性位點(diǎn)結(jié)合彌補(bǔ)了農(nóng)藥與之結(jié)合的損失[20]。綠茶中己唑醇、葉菌唑和普洱茶中三環(huán)唑呈現(xiàn)較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。而大多數(shù)農(nóng)藥在綠茶中的基質(zhì)效應(yīng)較普洱茶稍高，這可能是由于綠茶是未發(fā)酵茶，其中的活性成分如色素等造成的干擾更強(qiáng)。

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

使用優(yōu)化后的前處理方法檢測(cè)16例市售綠茶樣品和15例市售普洱茶樣品中13種三唑類(lèi)農(nóng)藥含量。2類(lèi)茶葉中各有1例多效唑檢出：綠茶樣品中檢出的1例含量為31.47 μg/kg，普洱茶中檢測(cè)出的1例含量為15.88 μg/kg。

多效唑在歐盟MRL標(biāo)準(zhǔn)中限量為20 μg/kg，則31例樣品中有1例綠茶超標(biāo)；在日本標(biāo)準(zhǔn)中，依據(jù)肯定列表制度—一律標(biāo)準(zhǔn)限量為10 μg/kg，則綠茶和普洱茶各有1例超標(biāo)。而在國(guó)內(nèi)現(xiàn)行的GB 2763—2016[21]中對(duì)于這種主要用作植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的農(nóng)藥只有其在谷物、油料油脂、蔬菜水果中的最大允許殘留限量，缺少其在茶葉中的限定標(biāo)準(zhǔn)，故無(wú)法評(píng)價(jià)。

3 結(jié) 論

研究建立了茶葉中13種三唑類(lèi)農(nóng)藥的定性定量檢測(cè)方法。樣品采用分散固相萃取凈化，對(duì)提取方式和填料配比方案進(jìn)行對(duì)比，使提取效率和凈化效果得到了優(yōu)化。使用氣相色譜- 四極桿- 飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)色譜升溫條件進(jìn)行了優(yōu)化，縮短了檢測(cè)時(shí)間。在建立的檢測(cè)條件下，節(jié)省了有機(jī)溶劑使用量，方法的回收率良好，檢出限符合歐盟標(biāo)準(zhǔn)的MRL限值，適用于茶葉中的13種三唑類(lèi)農(nóng)藥的定性定量分析。