張 蕾 牟翔宇 孫 鵬 于 洋 郜彥鑫 郭英慧

柴胡的基本功效是疏肝解郁，升舉陽氣，透表泄熱，在眾多抗抑郁復(fù)方中，柴胡類方占有重要地位，約占總數(shù)的1/3[1]。眾多實(shí)驗(yàn)表明，逍遙散、四逆散、柴胡疏肝散、安神解郁湯等在調(diào)節(jié)抑郁樣情緒方面有顯著效果，歸納看來，此類方劑均以柴胡為君藥，疏肝解郁，和解表里，以白芍為臣藥，養(yǎng)血柔肝，斂陰收汗，二者配伍使用一散一收，相互展其長(zhǎng)而避其短[2,3]。現(xiàn)代藥理研究表明，這些方劑中主要起效物質(zhì)為柴胡皂苷和芍藥苷[4]。柴胡皂苷是柴胡中最主要的活性成分，具有抗肝纖維化、抗病毒、保護(hù)肝細(xì)胞、抗腫瘤、抗炎、免疫的作用[5]。芍藥的主要活性成分為芍藥苷，芍藥苷對(duì)抗傷害性疼痛、免疫、抵抗炎癥等方面具有積極的作用[6]。雖然柴胡與白芍常配對(duì)出現(xiàn)在抗抑郁的處方中，但鮮有關(guān)于二者有效成分單獨(dú)配伍使用，對(duì)小鼠抑郁樣行為影響的報(bào)道，故本研究將就此進(jìn)行探討。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量18～22g，150只，日齡21～27天。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。采用按體重勻齊分組的方法將150只C57BL/6雄性小鼠分為3個(gè)組，即曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)組，再將3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別分為5組，即空白對(duì)照(control)組、氟西汀組、柴芍高劑量組、柴芍中劑量組和柴芍低劑量組，每組10只，5只一籠分籠飼養(yǎng)。小鼠于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持12h/12h明暗周期，晝夜顛倒，常規(guī)喂食喂水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作遵從于美國(guó)NIH頒布《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，小鼠按照藥量體質(zhì)量比0.1ml/10g標(biāo)準(zhǔn)開始灌胃給藥，陽性對(duì)照組灌胃氟西汀藥液。柴胡白芍(以下簡(jiǎn)稱柴芍)高、中、低劑量組，空白對(duì)照組給予同等量的載體溶劑。

2.試劑與儀器：柴胡提取液、白芍提取液均由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心藥劑實(shí)驗(yàn)室提供。柴胡、白芍按12∶10的生藥用量配伍(出自柴胡疏肝散)再通過人和小鼠的體表面積換算，計(jì)算出柴芍提取液低劑量組的濃度，依次進(jìn)行兩倍的換算推出高、中兩個(gè)劑量，最后得出柴胡、白芍按1.00g/kg∶0.80g/kg、0.50g/kg∶0.40g/kg、0.25g/kg∶0.20g/kg 3個(gè)高、中、低比例配伍，再分別回流提取2次10倍量的70%乙醇，每次提取1.5h，合并2次提取液，過濾除去藥渣，濾液減壓回收乙醇，并將提取液放于4℃冰箱保存[7，8]。氟西汀分散片購(gòu)自禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào):L01810，給藥時(shí)濃度為2mg/kg；Smart 3.0.0.5動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)、XR-SuperMaze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)、XR-XZ301曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)箱體、小鼠強(qiáng)迫游泳裝置等均購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司。

3.小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在灌胃第8天進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試當(dāng)天，各組小鼠均在用藥后0.5h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，輕抓握小鼠頸背部皮膚，放置于曠場(chǎng)箱的中央?yún)^(qū)域，待手完全不在視頻范圍中時(shí)，操作軟件開始記錄分析，每只小鼠采集時(shí)間為6min，由計(jì)算機(jī)記錄小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡，并分析中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間(s)。

4.小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)：小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)在灌胃第8天進(jìn)行測(cè)試。通過固定小鼠的尾部，使小鼠頭部向下，記錄處于該絕望狀態(tài)中小鼠產(chǎn)生的一系列不動(dòng)參數(shù)。測(cè)試當(dāng)天，各組小鼠均在用藥后0.5h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠尾端(在距尾尖2cm處)用膠帶固定在懸尾箱的中間橫桿上，使其呈倒懸狀態(tài)，頭部離懸尾箱底部約15cm。適應(yīng)2min后，利用軟件分析記錄4min之內(nèi)，累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(s)。

5.小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)在灌胃第8天進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試前1天小鼠放入高20cm、直徑10cm的圓柱型小鼠強(qiáng)迫游泳桶中適應(yīng)性游泳5min，測(cè)試當(dāng)天，給藥0.5h后將小鼠放入游泳桶中，每桶1只，水深10cm，水溫25±2℃，利用軟件分析記錄小鼠6min內(nèi)的懸浮不動(dòng)時(shí)間、懸浮不動(dòng)潛伏期及懸浮不動(dòng)次數(shù)。

結(jié) 果

1.柴芍提取液對(duì)小鼠曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間的影響：柴芍高劑量組和柴芍低劑量組相比空白對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而柴芍中劑量組和氟西汀組可明顯增加小鼠在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間(P<0.05)，改善其抑郁樣行為。中劑量組柴胡白芍提取液可以明顯改善小鼠抑郁樣行為，增加OFT實(shí)驗(yàn)中小鼠的中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，詳見表1。

表1 柴胡白芍提取液對(duì)小鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

2.柴胡白芍提取液對(duì)小鼠懸尾的影響：柴芍高、中、低劑量組和氟西汀組對(duì)比空白組可縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，上述劑量柴胡白芍提取液可顯著改善C57BL/6小鼠的抑郁樣行為，其中以氟西汀組和柴芍高劑量組效果更好，從而說明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁樣行為的作用，詳見表2。

表2 柴胡白芍提取液對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

3.柴胡白芍提取液對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響：柴芍高、中、低劑量組和氟西汀組對(duì)比空白對(duì)照組，可明顯縮短小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(P<0.05)，上述劑量柴胡白芍提取液可顯著改善C57BL/6小鼠的抑郁樣行為，其中以氟西汀組和柴芍低劑量組效果更好，從而說明柴胡白芍提取液有改善小鼠抑郁樣行為的作用，詳見表3。

表3 柴胡白芍提取液對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(C57BL/6小鼠)

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01

討 論

楊潔等[9]通過對(duì)比柴胡加龍骨牡蠣湯組、單味柴胡組、小柴胡類方組(去柴胡)、非小柴胡組(桂枝、茯苓、大黃、龍骨、牡蠣)發(fā)現(xiàn)，雖柴胡組、非小柴胡組都能明顯縮短小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間，增加5-HT誘導(dǎo)小鼠甩頭次數(shù)，但仍以全方柴胡加龍骨牡蠣湯的抗抑郁作用更好。于春泉等[8]通過對(duì)比柴芍高、中、低劑量組，白芍高、中、低劑量組，柴胡高、中、低劑量組，空白對(duì)照組以及氟西汀組，發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)中各給藥組均能明顯減少小鼠的不動(dòng)時(shí)間，但柴芍高劑量組對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響更為顯著。綜上所述，柴胡、白芍配伍使用對(duì)比柴胡、白芍單用時(shí)抗抑郁效果更明顯，且柴胡、白芍配伍使用不僅具有協(xié)同作用，還可以減少白芍單煎時(shí)有害物質(zhì)苯甲酸的量、在大鼠的腸道中柴胡皂苷可促進(jìn)芍藥苷的吸收、促進(jìn)白芍中芍藥苷溶出量等積極作用[11～13]。本研究中的柴胡白芍配伍比例出自明代張介賓《景岳全書》中的柴胡疏肝散，為疏肝解郁的良方，在臨床抗抑郁方面，取得了確切療效[13]。

腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)的代謝失常是抑郁癥發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說[14]。目前，國(guó)際上抗抑郁的一線藥物氟西汀、地西帕就分別是5-HT和NE的再攝取抑制劑[15]。柴胡提取液和白芍提取液中發(fā)揮主要藥理作用的物質(zhì)分別為柴胡皂苷和芍藥苷[16]。戈宏焱等[16]用柴芍皂苷對(duì)抑郁大鼠進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)和腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、高香草酸(HVA)的含量在原來下調(diào)的基礎(chǔ)上均有明顯的改善。此外，王靜霞等[17]通過白芍提取液干預(yù)抑郁大鼠發(fā)現(xiàn)，給藥后抑郁大鼠的行為變化顯著改善，大鼠腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NE)含量增加。

OFT、TST和FST是評(píng)價(jià)抗抑郁藥作用常用的3種動(dòng)物模型[19，20]。OFT是一項(xiàng)探究小鼠自發(fā)活動(dòng)和探索運(yùn)動(dòng)的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，常用來檢測(cè)抗抑郁和焦慮藥物。其原理是利用嚙齒類動(dòng)物處于抑郁狀態(tài)時(shí)，其活動(dòng)范圍會(huì)選擇相對(duì)安全的曠場(chǎng)箱體四周，避開相對(duì)空曠的曠場(chǎng)中央，當(dāng)嚙齒類動(dòng)物只要進(jìn)入空曠的中央?yún)^(qū)域，抑郁樣情緒改變的動(dòng)物，會(huì)對(duì)向箱體四周活動(dòng)產(chǎn)生遲疑，進(jìn)而增加了中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間。嚙齒類動(dòng)物被放置在特定的環(huán)境中由于無法逃脫，呈現(xiàn)出行為上的絕望，是懸尾和強(qiáng)迫游泳的實(shí)驗(yàn)原理。因此該實(shí)驗(yàn)選用這3種方法評(píng)價(jià)柴胡白芍提取液的對(duì)抑郁樣行為的影響，更具有科學(xué)性。

本研究通過小鼠行為絕望抑郁模型，發(fā)現(xiàn)柴芍中劑量組與氟西汀組可顯著增加小鼠在中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間，同時(shí)柴芍各給藥組，因?yàn)閯┝康牟町惪梢圆煌潭鹊挠绊懶∈髲?qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間，且各組對(duì)比空白對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示柴芍提取液具有較好的抗抑郁效果。柴芍高、中、低劑量組與氟西汀組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明利用中藥調(diào)節(jié)抑郁樣情緒與西藥有著相似的效果，利用柴胡和白芍配伍的中藥制劑治療與抑郁樣情緒相關(guān)的疾病發(fā)展前景相對(duì)良好。本研究發(fā)現(xiàn)柴芍提取液對(duì)小鼠的抑郁樣行為具有明顯的改善作用，為繼續(xù)深入研究柴芍提取液的抗抑郁作用提供了有力的支持。也為將柴胡配伍白芍發(fā)展成療效明確，質(zhì)量可控，作用機(jī)制確切的抗抑郁新藥奠定了良好的基礎(chǔ)。