趙 雪，郝 軍，戎贊華，蔣麗君，封曉娟，竇志艷

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院兒科，河北 石家莊 050000;2.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)增生是腎小球疾病進展的主要原因，目前血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)與增殖性腎炎發(fā)病的關(guān)系已經(jīng)被廣泛證實[1-2]。新近的研究顯示，在血管平滑肌細胞中，PDGF可以誘導(dǎo)periostin表達[3]，而細胞間基質(zhì)蛋白periostin與細胞增殖關(guān)系密切[4]，并在細胞外基質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[5]。PDGF促進系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)增生的作用是否通過periostin起作用，目前未見報道。

本研究以小鼠系膜細胞(mouse mesangial cell，MMC)為研究對象，PDGF為刺激物，以增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作為細胞的增殖指標，以纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作為細胞外基質(zhì)合成的指標，通過觀察PDGF刺激下periostin的表達及其與系膜細胞增殖、細胞外基質(zhì)合成的關(guān)系，并構(gòu)建periostin沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠系膜細胞內(nèi)，觀察轉(zhuǎn)染periostin沉默質(zhì)粒能否起到干預(yù)作用，為腎小球疾病進展的病因研究和靶向治療提供新的思路。

1 材料

1.1 細胞株MMC購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。

1.2 試劑兔抗periostin多克隆抗體(ab152099)，購自英國Abcam公司；兔抗FN多克隆抗體(15613-1-AP)、兔抗PCNA多克隆抗體(10205-2-AP)、TRITC-猴抗兔IgG，均購自美國Proteintech公司；兔抗TGF-β1多克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體，均購自美國Epitomics公司，pYr-adshuttle-4empty vector、pYr-ads-4-POSTON vector，購自長沙贏潤生物有限公司；重組鼠PDGF-BB(315-18)，購自美國PeproTech公司。

1.3 儀器高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；相差倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

2 方法

2.1 MMC細胞培養(yǎng)與實驗分組用含10%胎牛血清的DMEM/F12(3 ∶1)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)小鼠系膜細胞。① 細胞以6孔板培養(yǎng)24 h后，換含10 μg·L-1PDGF刺激物的培養(yǎng)基，孵育細胞0、2、4、6、12 h，收集細胞進行免疫熒光化學(xué)染色和細胞總蛋白提取。② Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染pYr-ads-4-POSTON vector及pYr-adshuttle-4empty vector空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后的細胞進行G418(800 mg·L-1)抗性篩選，傳代培養(yǎng)篩選出陽性克隆細胞。同步化后的細胞隨機分為control組、PDGF組、PDGF+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(PDGF+sh-nc)組和PDGF+ periostin沉默質(zhì)粒(PDGF+sh-periostin)組。后3組細胞以10 μg·L-1PDGF孵育6 h后終止培養(yǎng)，收集細胞，分別提取細胞總蛋白，進行免疫熒光化學(xué)染色。

2.2 Western blot檢測蛋白表達收集各組細胞并加入冰冷的裂解液200 μL，提取總蛋白。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，分裝后-80 ℃保存。50 μg蛋白樣品，加入加樣緩沖液，沸水變性5 min，10% SDS-PAGE凝膠電泳濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；5%脫脂奶粉稀釋一抗，periostin、PCNA、FN、TGF-β1及β-actin抗體(稀釋比例1 ∶1 000)4 ℃過夜。TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1 ∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜，滴加ECL增強化學(xué)發(fā)光試劑，Odyssey FC成像系統(tǒng)顯像。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對條帶進行分析，讀取積分光密度值(integrated option density，IOD)，目的蛋白條帶的IOD值除以β-actin條帶的IOD值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3 熒光細胞化學(xué)檢測細胞采用6孔板爬片，培養(yǎng)終止后，細胞用4 ℃生理鹽水沖洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；0.5% Triton X-100 37 ℃打孔10 min，PBS沖洗，每次5 min，共3次；正常山羊血清封閉，37 ℃孵育1 h；棄封閉液，滴加1 ∶200稀釋的periostin一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗，每次5 min，共3次; 滴加TRITC標記猴抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗，每次5 min，共5次; 滴加DAPI(1 ∶100配制)，37 ℃孵育10 min；PBS沖洗，每次5 min，共5次；熒光顯微鏡下觀察并攝取圖像。

3 結(jié)果

3.1 PDGF誘導(dǎo)periostin蛋白高表達10 μg·L-1PDGF刺激MMC后，periostin蛋白表達明顯升高。Fig 1的Western blot結(jié)果顯示，刺激2 h后periostin水平開始升高，6 h達到高峰，表達上調(diào)2.69倍，12 h明顯回落。同樣Fig 2的細胞免疫熒光結(jié)果顯示，PDGF刺激后periostin的表達明顯增強，主要定位在胞質(zhì)，而在0 h組，periostin僅在胞質(zhì)有微弱表達。

Fig 1 Expression of periostin and PCNA protein in MMC stimulated by PDGF detected by Western

*P<0.05vs0 h group

3.2 PDGF誘導(dǎo)MMC增殖和細胞外基質(zhì)合成10 μg·L-1PDGF刺激MMC后，PCNA蛋白表達明顯升高，F(xiàn)ig 1的Western blot結(jié)果顯示，刺激2 h后PCNA開始升高，6 h達到高峰，表達上調(diào)2.31倍，12 h明顯回落。Fig 3結(jié)果顯示，PDGF刺激后，F(xiàn)N、TGF-β1蛋白的表達明顯上調(diào)，刺激4 h后，F(xiàn)N、TGF-β1蛋白的表達明顯增加，6 h達高峰，分別較0 h組升高2.31、2.50倍。

Fig 2 Expression of periostin protein in MMC stimulated by PDGF detected by immunofluorescence(scale bar: 50 μm)

Blue: DAPI staining.

Fig 3 Expression of FN, TGF-β1 protein in MMC stimulated by PDGF detected by Western

*P<0.05vs0 h group

3.3 Periostin沉默質(zhì)粒抑制PDGF引起的PCNA蛋白的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)ig 4的Western blot結(jié)果顯示，與PDGF刺激的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染sh-periostin沉默質(zhì)粒(pYr-ads-4-POSTON vector)使periostin的蛋白表達明顯下降，較空質(zhì)粒組下降60.40%。同樣Fig 5細胞免疫熒光結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染sh-periostin沉默質(zhì)粒組periostin蛋白的胞質(zhì)表達明顯減少。Western blot進一步檢測了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并給予PDGF刺激后PCNA的蛋白表達，結(jié)果PCNA表達明顯下降，較空質(zhì)粒組降低47.74%(Fig 6)。

Fig 4 Expression of periostin protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF+sh-nc group

Fig 5 Expression of periostin protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by immunofluorescence(scale bar: 100 μm)

A:Control; B: PDGF; C: PDGF+sh-nc; D: PDGF+sh-periostin. Blue: DAPI staining.

3.4 Periostin沉默質(zhì)粒抑制PDGF引起的FN、TGF-β1蛋白的表達Western blot進一步檢測了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并給予PDGF刺激后FN和TGF-β1的蛋白表達。如Fig 7所示，與PDGF刺激的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，F(xiàn)N、TGF-β1的蛋白表達明顯降低，分別下降57.77%、50.41%。

4 討論

PDGF作為目前已知多肽生長因子中最強的有絲分裂原，與多種細胞增殖密切相關(guān)[6-7]，其過度表達與腎臟疾病的關(guān)系已被大量的實驗所證實。PDGF可以刺激系膜細胞及單核巨噬細胞增殖、轉(zhuǎn)型，并進一步刺激細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[1-2]。近來的研究顯示，PDGF可以誘導(dǎo)periostin在血管平滑肌細胞中的表達[3]，在系膜細胞中，PDGF能否誘導(dǎo)periostin的表達少見研究。最近，periostin在腎臟疾病中的作用受到越來越多的關(guān)注，PDGF促進系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)增生的作用是否與periostin有關(guān)，尚未見報道。本實驗Western blot與免疫熒光的結(jié)果顯示，PDGF上調(diào)periostin蛋白表達，同時使PCNA和FN、TGF-β1的蛋白表達明顯升高，表明PDGF上調(diào)系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成水平，可能與上調(diào)periostin蛋白表達有關(guān)。

Fig 6 Expression of PCNA protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by Western

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF+sh-nc group

Fig 7 Expression of FN, TGF-β1 protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by Western

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPDGF+sh-nc group

Periostin是細胞間基質(zhì)蛋白的一種[8]，是αvβ1、β3、β4和β5整合素的配體。大量研究顯示，periostin與細胞增殖、分化、黏附等關(guān)系密切，periostin在多囊腎的囊壁上皮細胞過表達，能夠促進囊壁上皮細胞增殖，periostin敲除鼠與periostin(+/+)鼠相比，腎細胞增殖減輕，腎囊數(shù)目和總的囊面積減少，生存期明顯延長[9]。periostin在細胞外基質(zhì)的代謝中也發(fā)揮重要作用，與多種組織纖維化有關(guān)[10-11]。腎小管上皮細胞給予periostin刺激后，Ⅰ型膠原表達增加[12]。野生型單側(cè)輸尿管閉塞模型鼠梗阻側(cè)腎臟periostin的表達、合成和腎損傷進行性增加，periostin敲除鼠則顯示腎臟纖維化減輕，結(jié)構(gòu)改善[13]。由缺氧或缺血引發(fā)的急性腎損傷小鼠，periostin通過p38 MAPK途徑促進腎臟纖維化[14]。

為了進一步探討PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成增加是否確實與上調(diào)periostin相關(guān)，我們轉(zhuǎn)染了periostin沉默質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)與PDGF刺激的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染sh-periostin質(zhì)粒組periostin的蛋白表達下降，同時PCNA、FN、TGF-β1蛋白表達明顯減弱，提示periostin沉默質(zhì)粒能夠逆轉(zhuǎn)PDGF引起的系膜細胞PCNA、FN、TGF-β1蛋白表達，PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)產(chǎn)生通過periostin起作用。

我們下一步的研究將在體外實驗的基礎(chǔ)上，將periostin沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至增殖性腎炎小鼠體內(nèi)，從整體水平上探討periostin在增殖性腎炎中的作用，為腎臟疾病進展的防治提供思路。

(致謝: 本實驗于河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)實驗室完成，感謝實驗室全體老師的幫助。)