吳紫璇，郝征，郭亞萍，張翟軼，陳璐瑤，彭雁飛△，鄭紡△

全世界范圍內(nèi)因交通事故、工傷、運(yùn)動(dòng)創(chuàng)傷或疾病等原因造成的骨缺損、骨折的傷患人數(shù)每年高達(dá)幾百萬。由于骨結(jié)構(gòu)的特殊性，即使能夠愈合，亦常需要長達(dá)幾周甚至幾個(gè)月的固定、限制活動(dòng)，往往會(huì)導(dǎo)致肢體廢用性萎縮、關(guān)節(jié)粘連、褥瘡、呼吸及泌尿系感染等多種并發(fā)癥，極大影響了患者的勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量。目前臨床上多采用骨組織工程學(xué)技術(shù)來治療該類疾病，即將體外培養(yǎng)的高濃度種子細(xì)胞種植于人工或天然合成的細(xì)胞外基質(zhì)載體上，并復(fù)合相關(guān)誘導(dǎo)因子，然后移植于體內(nèi)，從而達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，即使是利用傳統(tǒng)組織工程學(xué)修復(fù)骨缺損也存在著免疫排斥等缺陷［1］，因此尋找安全有效的治療骨缺損方法成為目前骨傷科治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

骨碎補(bǔ)是骨傷科的常用中藥，多用于治療骨相關(guān)疾病，具有很好的療效。骨碎補(bǔ)總黃酮（assemble flavone of rhizome drynaria，AFRD）是骨碎補(bǔ)的主要有效成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，AFRD能夠提高廢用性骨質(zhì)疏松大鼠的骨組織體積、骨小梁密度和厚度［2］。同時(shí)有研究表明，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/趨化因子受體4（SDF1/CXCR4）信號(hào)途徑與骨缺損修復(fù)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）遷移密切相關(guān)，能夠參與骨缺損部位的骨再生［3］。此外，SDF1/CXCR4信號(hào)途徑本身也能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移至受損部位，參與骨缺損修復(fù)。然而，骨碎補(bǔ)治療骨缺損的作用是否與其促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移及SDF1/CXCR4信號(hào)途徑相關(guān)，目前鮮有報(bào)道。因此，本研究以乙醇超聲法從強(qiáng)骨膠囊中獲取AFRD，以小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST-2為研究對(duì)象，觀察AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞遷移及SDF1/CXCR4信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)作用，以期為揭示骨碎補(bǔ)治療骨缺損的作用機(jī)制提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 強(qiáng)骨膠囊（主要成分為AFRD，每250 mg強(qiáng)骨膠囊含AFRD不少于180 mg）購自北京岐黃制藥公司；α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Trizol LS購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；定量PCR試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；CXCR4抗體、GAPDH抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系ST-2培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，于在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每隔2 d換液1次。待細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2CCK-8法檢測ST-2細(xì)胞增殖 使用0.25%的胰蛋白酶消化ST-2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種至96孔板中，而后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。分別使用對(duì)照試劑DMSO（control）和不同濃度（5、20、50、100 mg/L）的AFRD處理細(xì)胞0、24、48和72 h，每種處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。干預(yù)期滿后，根據(jù)CCK-8試劑盒說明，在每孔培養(yǎng)基中加入10%CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h。使用酶標(biāo)儀檢測各孔培養(yǎng)基在450 nm處的光密度（OD）值，評(píng)價(jià)AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3Transwell法檢測ST-2細(xì)胞的遷移 將Transwell小室放置于24孔板中，消化ST-2細(xì)胞，以含不同濃度AFRD的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并以5×104個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種于Transwell上室。在下室中加入含10%FBS的培養(yǎng)基以形成營養(yǎng)梯度，并于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)期滿后，吸棄Transwell上室中的培養(yǎng)基，并用棉簽蘸除上室的細(xì)胞，將小室置于4%多聚甲醛中室溫下固定1 h，取出小室風(fēng)干后，使用0.01%的結(jié)晶紫染色30 min，用PBS漂洗2次去除浮色。晾干小室后，將其置于倒置顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率=（24 h穿膜細(xì)胞數(shù)-0 h穿膜細(xì)胞數(shù)）/0 h穿膜細(xì)胞數(shù)×100%，評(píng)價(jià)不同濃度AFRD對(duì)細(xì)胞遷移的影響。

1.2.4熒光定量PCR檢測SDF1和CXCR4的基因表達(dá) 使用不同濃度的AFRD（5、20、50、100 mg/L）干預(yù)ST-2細(xì)胞48 h，使用細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA單鏈，逆轉(zhuǎn)錄條件為25℃ 10 min，37℃ 30 min，42℃30 min，85℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄具體操作步驟按Applied Biosystems公司TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參基因，熒光定量PCR檢測SDF1和CXCR4的mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火10 s，共45個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，目的基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算。熒光定量PCR擴(kuò)增的基因引物序列見表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by fluorescence quantitative PCR表1 熒光定量PCR擴(kuò)增基因引物序列

1.2.5Western blot檢測CXCR4的蛋白表達(dá) 不同濃度的AFRD（5、20、50、100 mg/L）干預(yù)ST-2細(xì)胞72 h后，使用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并使用BCA蛋白定量法檢測濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PBST漂洗后，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后用PBST漂洗，加入CXCR4一抗（稀釋比例1∶2 000），4℃孵育過夜。將膜取出放入PBST溶液中，搖床震蕩漂洗3次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。孵育結(jié)束后使用PBST漂洗3次，每次15 min。加入顯影液拍照，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.6CXCR4抑制劑AMD3100干預(yù)實(shí)驗(yàn) 使用50 mg/L AMD3100干預(yù)ST-2細(xì)胞，Transwell實(shí)驗(yàn)觀察SDF1/CXCR4信號(hào)途徑阻斷后，AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞遷移作用的變化，熒光定量PCR和Western blot檢測AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞中SDF1和CXCR4基因表達(dá)水平的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量資料方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞增殖的影響 對(duì)于CCK-8法檢測結(jié)果，經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析，組別（F=26.680，P＜0.001）、時(shí)間（F=465.780，P＜0.001）、組別與時(shí)間的交互作用（F=7.785，P＜0.001）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除5 mg/L外，20、50、100 mg/L AFRD處理24、48和72 h，ST-2細(xì)胞增殖明顯增加，與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

Fig.1 Effects of AFRD on proliferation of ST-2 cells圖1 AFRD對(duì)ST-2細(xì)胞增殖的影響

2.2AFRD對(duì)ST-2遷移能力的影響 結(jié)果顯示，control組與5、20、50、100 AFRD組的ST-2細(xì)胞遷移能 力 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（n=6，F(xiàn)=229.882，P＜0.001）。5、20、50、100 mg/L AFRD干預(yù)ST-2細(xì)胞24 h后，與control組比較，ST-2細(xì)胞的遷移能力明顯提高，且隨濃度升高而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖2。

Fig.2 AFRD promotes the migration of ST-2 cells圖2 AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞遷移

2.3AFRD對(duì)SDF1和CXCR4基因表達(dá)的影響

2.3.1AFRD對(duì)SDF1和CXCR4基因mRNA表達(dá)的影響 Control組與5、20、50、100 mg/L AFRD組的SDF1基因的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=47.696，P＜0.001）。與control組相比，5、20、50、100 mg/L AFRD均可明顯上調(diào)ST-2細(xì)胞內(nèi)SDF1基因的mRNA表達(dá)（P＜0.05），但各濃度AFRD上調(diào)SDF1的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各濃度AFRD均可明顯上調(diào)CXCR4基因的mRNA表達(dá)（n=6，F(xiàn)=35.147，P＜0.001），且隨濃度增加，上調(diào)作用越顯著，呈現(xiàn)出濃度依賴性，見圖3。

Fig.3 Effects of AFRD on mRNA expression of SDF1 and CXCR4圖3 AFRD對(duì)SDF1和CXCR4 mRNA表達(dá)的影響

2.3.2AFRD對(duì)CXCR4蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與control組比較，5、20、50、100 mg/L AFRD明顯上調(diào)ST-2細(xì)胞內(nèi)CXCR4的蛋白表達(dá)（F=13.466，P＜0.001），并有隨AFRD的濃度增加，上調(diào)作用越顯著的趨勢。見圖4。

2.4AMD3100逆轉(zhuǎn)AFRD促ST-2細(xì)胞遷移和上調(diào)SDF1和CXCR4基因表達(dá) 選擇促ST-2細(xì)胞遷移作用最明顯的50 mg/L AFRD進(jìn)行SDF1/CXCR4通路抑制實(shí)驗(yàn)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的ST-2細(xì)胞遷移能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=69.642，P＜0.001）。與50 mg/L AFRD組比較，CXCR4抑制劑AMD3100干預(yù)后，AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞遷移的作用被抑制（P＜0.001），見圖5。此外，control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的SDF1和CXCR4 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為224.339、1 428.424，P＜0.001），與50 mg/L AFRDz組比較，AMD3100抑制了AFRD對(duì)SDF1和CXCR4 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用，見圖6。Control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的CXCR4的蛋白表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.733，P＜0.05），與50 mg/L AFRD比較，AMD3100抑制AFRD對(duì)和CXCR4蛋白的上調(diào)作用，見圖7。

Fig.4 AFRD promoted the protein expression of CXCR4 in ST-2 cells圖4 AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞中CXCR4的蛋白表達(dá)

Fig.5 AMD3100 blocked the migration of ST-2 cells induced by AFRD圖5 AMD3100阻斷AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞的遷移作用

3 討論

Fig.6 AMD3100 blocked the up-regulation effect on the mRNA expression of SDF1 and CXCR4 induced by AFRD圖6 AMD3100阻斷AFRD對(duì)SDF1和CXCR4 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用

Fig.7 AMD3100 blocked the up-regulation effect on proteinexpression of CXCR4 induced by AFRD圖7 AMD3100阻斷AFRD對(duì)CXCR4蛋白表達(dá)的上調(diào)作用

3.1骨髓基質(zhì)細(xì)胞的遷移及調(diào)控與骨損傷的關(guān)系 骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一類成體骨髓中的多能干細(xì)胞，能夠在適宜誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和其他幾種結(jié)締組織細(xì)胞（如腱細(xì)胞）等。在發(fā)生骨損傷時(shí)，盡管骨折斷端周圍也存在骨髓基質(zhì)細(xì)胞，但僅能滿足輕度骨缺損或骨折修復(fù)的需要。對(duì)于嚴(yán)重或大塊的骨缺損，即使植入自體骨、異體骨或組織工程骨，除植骨周圍有少量細(xì)胞存活外，大部分骨缺損區(qū)域內(nèi)缺乏足夠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞。顯然，骨損傷修復(fù)過程中，損傷局部聚集足夠數(shù)目的骨髓基質(zhì)細(xì)胞是促進(jìn)骨修復(fù)的前提條件和重要的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。趨化因子家族及其受體是操控骨髓基質(zhì)細(xì)胞動(dòng)員和遷移的重要因子。SDF1即CXCL12，屬于趨化因子家族中的CXC亞族，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，具有強(qiáng)大的趨化作用，其特異性受體CXCR4在許多細(xì)胞表面表達(dá)。SDF1與其受體CXCR4構(gòu)成的SDF1/CXCR4信號(hào)途徑在骨髓基質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)員與定向遷移中發(fā)揮了重要作用［4］。發(fā)生骨損傷時(shí)，SDF1/CXCR4信號(hào)途徑能夠募集骨髓基質(zhì)細(xì)胞趨化遷移到損傷部位，參與骨再生修復(fù)。

3.2AFRD治療骨損傷的具體作用機(jī)制尚不明確 《本草新編》記載：骨碎補(bǔ)，味苦，氣溫，無毒，入骨，用之以補(bǔ)接傷碎最神。歸肝、腎經(jīng)，具有止痛、補(bǔ)腎、強(qiáng)骨的功效，主要用于治療跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、牙齒松動(dòng)等相關(guān)病癥［5］。臨床上骨碎補(bǔ)多用于治療骨質(zhì)疏松癥及骨缺損等骨科相關(guān)疾病，具有很好的療效［6］。研究報(bào)道，大于1 000 mg/L的骨碎補(bǔ)不會(huì)引起斑馬魚內(nèi)臟中毒，2 000 mg/L骨碎補(bǔ)對(duì)斑馬魚幼魚無毒性，這些結(jié)果有力證明了骨碎補(bǔ)的安全性［7］。骨碎補(bǔ)總黃酮是骨碎補(bǔ)主要活性成分，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，給骨缺損模型鼠灌服骨碎補(bǔ)后，在動(dòng)物血清中能夠檢測到包括黃芪苷、柚皮苷、木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷在內(nèi)的8種黃酮［8］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，骨碎補(bǔ)總黃酮能夠提高股骨干缺損大鼠的骨密度，維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度，有利于骨缺損的恢復(fù)；且骨碎補(bǔ)總黃酮的治療效果優(yōu)于骨碎補(bǔ)的質(zhì)控成分——單一黃酮類化合物柚皮苷［9］。另有研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮能夠提高大鼠顱骨骨缺損的愈合過程中血Ca、P、堿性磷酸酶（ALP）的濃度，促進(jìn)缺損部位的愈合［10］，但是具體作用機(jī)制還不甚明確。有研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)提取物能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化，并且促進(jìn)趨化因子CXCL12的分泌［11］，提示骨碎補(bǔ)修復(fù)骨損傷的作用可能與其促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞趨化到損傷部位存在關(guān)聯(lián)，但骨碎補(bǔ)總黃酮能否促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移，且該作用是否通過SDF1/CXCR4信號(hào)通路介導(dǎo)并不明確。

3.3AFRD可能通過SDF1/CXCR4信號(hào)通路介導(dǎo)ST-2細(xì)胞遷移修復(fù)骨損傷 本研究觀察了AFRD對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移的影響及SDF1/CXCR4信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)AFRD能夠增強(qiáng)ST-2細(xì)胞的遷移能力，且隨著AFRD濃度的升高作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性。同時(shí)，AFRD能夠促進(jìn)ST-2細(xì)胞內(nèi)SDF1和CXCR4的基因及CXCR4蛋白表達(dá)；而CXCR4抑制劑AMD3100干預(yù)后能夠抑制AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞遷移及上調(diào)CXCR4基因表達(dá)的作用，以上實(shí)驗(yàn)證明AFRD促進(jìn)ST-2細(xì)胞遷移的作用可能是通過SDF1/CXCR4信號(hào)途徑介導(dǎo)的。

綜上所述，基于本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為AFRD修復(fù)骨損傷的作用與其促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移至骨缺損部位有關(guān)，且這一作用是通過激活SDF1/CXCR4信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，除了促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移外，AFRD修復(fù)骨損傷的作用是否還可能通過其他作用機(jī)制發(fā)揮作用，包括促進(jìn)損傷部位血管新生等還有待進(jìn)一步探討。