朱國(guó)玲，成蘭云，張恒，田浩，門秀麗△

胰島素瘤是功能性胰腺內(nèi)分泌腫瘤中最常見(jiàn)的一種，來(lái)源于胰島β細(xì)胞［1-2］，該腫瘤具有較強(qiáng)的自主分泌胰島素能力，并且胰島素的分泌不受低血糖抑制，臨床上常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作并逐漸加重的低血糖，甚至危及生命［3］。長(zhǎng)期低血糖不僅可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制癥狀，并且可誘發(fā)大量?jī)翰璺影奉愇镔|(zhì)釋放入血引起交感神經(jīng)興奮癥狀。因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，極易引起漏診、誤診和誤治［4-5］，有報(bào)道超過(guò)40%的胰島素瘤病例初診為神經(jīng)系統(tǒng)疾病［6-7］。盡管在過(guò)去30年胰島素瘤發(fā)生率有明顯升高［8］，但目前胰島素瘤仍屬于較少見(jiàn)的疑難病癥，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解較少，該類腫瘤的生物學(xué)特性尚有待研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠胰島素瘤既表達(dá)胰島素基因，也表達(dá)胰高血糖素基因［9］，但有關(guān)胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用本課題組已經(jīng)成功構(gòu)建的胰島素瘤裸鼠模型［9］，觀察敲降胰高血糖素基因?qū)σ葝u素瘤形成的影響，為進(jìn)一步探討胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 （1）細(xì)胞。大鼠胰島素瘤細(xì)胞系（INS-1細(xì)胞）、大鼠胰島α細(xì)胞系（INR-1G9細(xì)胞）、INS-1細(xì)胞的單細(xì)胞克?。╮9細(xì)胞）、人胰島素瘤細(xì)胞、293T細(xì)胞、人近端腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2細(xì)胞），上述細(xì)胞系均由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所婁晉寧教授惠贈(zèng)。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。nu/nu裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2006-0009，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，均為雄性，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養(yǎng)。（3）主要試劑與儀器。1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，胰蛋白酶、鏈脲佐菌素、氨芐青霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，葡萄糖購(gòu)自中國(guó)大冢制藥有限公司，精氨酸購(gòu)自上海信誼藥業(yè)有限公司，去甲腎上腺素、乙酰膽堿（TGI）均購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，胰島素（insulin）ELISA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，胰高血糖素（glucagon）放射免疫分析試劑盒購(gòu)自中國(guó)原子高科股份有限公司，兔抗insulin多克隆抗體、羊抗glucagon多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，BCA法蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，HB101化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，pLVTHM-shglucagon慢病毒質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所婁晉寧教授惠贈(zèng)。ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司，紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，SN-6105γ放射免疫計(jì)數(shù)器購(gòu)自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司，全自動(dòng)激光共聚焦顯微鏡1X81購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞、INR-1G9細(xì)胞、r9細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞用1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L，5.5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES，50μmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L丙酮酸鈉），其中r9細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)另外添加100 mg/L G418；HK-2細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清，青霉素/鏈霉素1.0×104U/L），各種細(xì)胞于5%CO2，37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為90%時(shí)用0.025%胰蛋白酶/EDTA傳代。

1.3激光共聚焦顯微鏡觀察INS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素的表達(dá) 將INS-1細(xì)胞（1×105/孔）、人胰島素瘤細(xì)胞（5×104/孔）和HK-2細(xì)胞（5×104/孔）接種于激光共聚焦專用的培養(yǎng)皿中，72 h后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗2次，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞20 min，PBS洗2次后，用0.1%Triton X-100+0.1%檸檬酸鈉冰上通透8 min，PBS洗2次后，0.1%BSA/PBS/Tween 20室溫封閉20 min。PBS洗2次，然后用1∶80稀釋的兔抗鼠胰島素抗體4℃孵育過(guò)夜。PBS洗2次后，用1∶50稀釋的cy3標(biāo)記的羊抗兔一抗，37℃孵育50 min，PBS洗3次。然后加入1∶80稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，37℃孵育60 min，PBS洗2次，再加入1∶150稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗羊二抗，37℃孵育50 min，用PBS洗3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光的強(qiáng)弱并拍照，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。

1.4胰高血糖素基因敲降

1.4.1pLVTHM-shglucagon慢病毒載體構(gòu)建 Shglucagon（Gcg glucagon［Rattus norvegicus］Gene ID：24952）質(zhì)粒由華大基因合成。pLVTHM-shglucagon正義鏈：5'-CGCGTACTAGTCCCCGGAAGAAGTCGCCATAGCTGATTCA AGAGATCAGCTATGGCGACTTCTTCCTTTTTGGAAAT-3'，反義鏈：5'-CGATTTCCAAAAAGGAAGAAGTCGCCATAGCT GATCTCTTGAATCAGCTATGGCGACTTCTTCCGGGGACTAG TA-3'，通過(guò)Oligo退火合成shDNA，在T4 DNA連接酶作用下，與退火的DNA oligo于4℃連接16 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。用磷酸鈣-DNA共沉淀法共轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞HEK-293T，進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝。感染前24 h，調(diào)整293T細(xì)胞密度為2×106/L，接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)即可感染。3種質(zhì)粒［pLVTHM-shglucagon（同時(shí)可表達(dá)綠色熒光蛋白）20μg、pMD2G 5μg和psPAX2 15μg］按比例混合后用無(wú)菌去離子水調(diào)到250μL，加入250μL 0.5 mol/L CaCl2混合均勻，然后逐滴緩慢加入500μL 2×HeBS，以最大速度渦旋混勻。實(shí)驗(yàn)臺(tái)上靜置30 min，然后稀釋到10 mL新鮮培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)瓶，溫和振動(dòng)培養(yǎng)瓶使沉淀物均勻分布到細(xì)胞單層上。培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入15 mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染48 h和72 h后收集細(xì)胞上清培養(yǎng)基，4℃，3 000 r/min離心10 min收集上清并用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，慢病毒上清分裝到5 mL無(wú)菌EP管中，-80℃保存，可以直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞。同樣方法制備僅含綠色熒光蛋白（GFP）報(bào)告基因的陰性對(duì)照慢病毒載體。

1.4.2慢病毒感染INS-1細(xì)胞 將上述分裝的慢病毒上清從-80℃冰箱取出，慢病毒上清與目的細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比例為1∶2或1∶3，轉(zhuǎn)導(dǎo)INS-1細(xì)胞4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)感染情況將同時(shí)間點(diǎn)的INS-1細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組，不進(jìn)行感染，其他培養(yǎng)條件同各感染組；單純轉(zhuǎn)染慢病毒（N-pLV）組，感染pLVTHM，即只含有GFP；敲降胰高血糖素（N-pLV-G）組，感染pLVTHM-shglucagon。48 h在熒光顯微鏡下觀察目的細(xì)胞熒光強(qiáng)弱可以初步判斷慢病毒是否感染成功，繼續(xù)培養(yǎng)至60 d，分別觀察30 d、60 d時(shí)細(xì)胞的熒光強(qiáng)弱變化。

1.4.3RT-PCR檢測(cè)胰高血糖素基因的表達(dá) 將3組細(xì)胞以2×105/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，應(yīng)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后收集各組細(xì)胞，應(yīng)用Promega試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。胰高血糖素基因的引物序列：上游5'-GTTTACATCGTGGCTGGATTG-3'，下游5'-TGAATTCCTTTGCTGCCTGGC-3'，擴(kuò)增片段 349 bp。參照Promega RT-PCR system試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，50μL反應(yīng)體系添加0.1μg模板，上、下游引物的終濃度分別為1μmol/L。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描采集圖像。

1.4.4Western blot檢測(cè)胰高血糖素蛋白的表達(dá)水平 將3組細(xì)胞以1×105分別接種6孔培養(yǎng)板，3 d后收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白量。樣本經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（120 V恒壓）分離，然后按照200 mA恒流電轉(zhuǎn)移70 min，將蛋白自凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)去離子水清洗后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后加入1∶500稀釋的羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗后用1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗羊IgG二抗孵育1.5 h，漂洗后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線片顯影。利用美國(guó)Bio-Rad公司紫外凝膠成像系統(tǒng)對(duì)X線片上的條帶進(jìn)行平均光密度（IOD）值測(cè)量。以βactin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5細(xì)胞分泌功能的檢測(cè) 將3組細(xì)胞分別種于24孔板，2×106/孔中，每組3個(gè)平行孔。培養(yǎng)72 h后，用含2.5 mmol/L葡萄糖（glucose）的培養(yǎng)基平衡5 h，然后用KRBH（Krebs-Ringer bicarbonate HEPES buffer）液洗2次，分別加入2.5、20 mmol/L glucose的KRBH 0.5 mL，并加入抑肽酶使其終濃度為1 mg/L，刺激細(xì)胞2 h，收集上清液，用于胰島素和胰高血糖素測(cè)定。胰島素測(cè)定采用ELISA法，胰高血糖素的測(cè)定采用放射免疫分析法，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4.6MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 將空白對(duì)照組、單純轉(zhuǎn)染慢病毒組和敲降胰高血糖素組細(xì)胞以9×103/孔分別種于96孔板中，用培養(yǎng)液調(diào)整每孔終體積為200μL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)第0、1、3、5、7天從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板測(cè)量細(xì)胞量，首先輕輕吸出每孔培養(yǎng)液，然后每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液30μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，小心吸去每孔內(nèi)培養(yǎng)液之后，每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩，槍頭吹吸混勻，待細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶紫完全溶解后，在ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀設(shè)置波長(zhǎng)492 nm處讀取每孔光密度（OD）值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 利用本課題組已成功構(gòu)建的大鼠胰島素瘤動(dòng)物模型［9］。首先刮取3組細(xì)胞，將其分別移植到裸鼠左腎包膜下，在0、1、2、3、4、5、6周監(jiān)測(cè)血糖變化。實(shí)驗(yàn)第45天處死動(dòng)物，取出雙側(cè)腎臟，肉眼觀察比較不同組動(dòng)物腎臟大小并拍照。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。即取部分移植部位腎臟經(jīng)10%福爾馬林液固定后，制備石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，微波熱修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。一抗分別使用兔抗鼠胰島素抗體、羊抗鼠胰高血糖素抗體，4℃孵育過(guò)夜，二抗使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體或兔抗羊IgG抗體，37℃30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明封片后鏡檢，采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析免疫組織化學(xué)染色樣本的IOD值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)；2組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胰島素瘤細(xì)胞的特性分析 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，INS-1細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)胰島素和胰高血糖素；但作為對(duì)照的腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞中兩者都不表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2胰高血糖素在胰島素瘤形成中的作用

2.2.1INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因敲降株的建立 pLVTHM與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后，細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)的GFP（圖2A），表明慢病毒包裝成功。將包裝好的病毒感染INS-1細(xì)胞后，INS-1細(xì)胞表達(dá)GFP（圖2B），隨著傳代培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在30 d（圖2C）和60 d（圖2D）時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GFP的表達(dá)無(wú)明顯變化，而與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，敲降后INS-1細(xì)胞中胰高血糖素mRNA（IOD，0.53±0.14vs.1.37±0.42，t=3.184，P＜0.05）和蛋白表達(dá)水平（IOD，0.28±0.06vs.0.96±0.12，t=4.351，P＜0.05）均明顯降低（圖3），說(shuō)明胰高血糖素基因敲降成功。

Fig.1 The expressions of insulin and glucagon in cells of each group(Immunofluorescence staining,×1 500)圖1 各組細(xì)胞胰島素和胰高血糖素基因的表達(dá)（免疫熒光染色，×1 500）

Fig.2 The glucagon gene knock down in INS-1 cells(×200)圖2 INS-1細(xì)胞中胰高血糖素基因的敲降（×200）

Fig.3 Effects of glucagon gene knockdown on INS-1 cells圖3 INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因的敲降效果

2.2.2敲降胰高血糖素對(duì)INS-1細(xì)胞分泌功能的影響 敲降INS-1細(xì)胞胰高血糖素基因72 h后，3組低濃度（2.5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡糖糖刺激的胰島素的分泌未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）；敲降胰高血糖素組低濃度、高濃度葡糖糖刺激的胰高血糖素分泌較空白對(duì)照組和單純轉(zhuǎn)染慢病毒組明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因?qū)Σ煌瑵舛绕咸烟谴碳NS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

Tab.1 Effects of glucagon knockdown gene on insulin and glucagon secretion in INS-1 cells stimulated by different concentrations of glucose表1 敲降胰高血糖素基因?qū)Σ煌瑵舛绕咸烟谴碳NS-1細(xì)胞胰島素和胰高血糖素分泌功能的影響 （μg/L，n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對(duì)照組比較，b與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組N-pLV組N-pLV-G組F胰島素2.5 mmol/L 11.06±1.06 12.29±0.83 11.55±0.88 1.298 20 mmol/L 48.59±2.45 52.09±2.25 55.14±3.87 6.075胰高血糖素2.5 mmol/L 73.45±5.25 78.24±2.50 31.70±1.84ab 158.699＊20 mmol/L 694.79±16.85 692.33±12.30 285.57±15.25ab 749.93＊

2.2.3敲降胰高血糖素對(duì)INS-1細(xì)胞增殖能力的影響 MTT結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染空載慢病毒對(duì)細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯影響（P＞0.05），但敲降胰高血糖素基因可以明顯降低INS-1細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Fig.4 Effects of glucagon knockdown on proliferation of INS-1 cells圖4 敲降胰高血糖素對(duì)INS-1細(xì)胞增殖能力的影響

2.2.4體內(nèi)移植 3組裸鼠血糖在移植第1、2周時(shí)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；移植第3、4、5周時(shí)，3組血糖逐漸下降，但敲降胰高血糖素組血糖仍高于同時(shí)期的空白對(duì)照組和單純轉(zhuǎn)染慢病毒組（P＜0.05）；至移植第6周時(shí)3組血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。腎臟大體形態(tài)觀察結(jié)果顯示，敲降胰高血糖素組腎臟腫瘤較單純轉(zhuǎn)染慢病毒組有所減小，見(jiàn)圖6。免疫組化染色結(jié)果顯示，與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，敲降胰高血糖素組細(xì)胞胰島素（IOD）的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（1.67±0.29vs.1.58±0.32，t=0.361，P＞0.05），而胰高血糖素（IOD）表達(dá)降低（0.43±0.08vs.1.51±0.24，t=7.394，P＜0.05），見(jiàn)圖7。

Fig.5 The changes of blood glucose in INS-1 cells after glucagon knockdown and transplanted into the left kidney capsule of nude mice圖5 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下后血糖水平的變化

Fig.6 Tumorigenicity after glucagon knockdown in INS-1 cells and transplanted into the left kidney capsule圖6 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植到裸鼠左腎包膜下后的成瘤情況

3 討論

胰島素瘤起源于胰島β細(xì)胞，約87%屬于良性腫瘤［10］，其中具有胰島素分泌功能的功能性胰島素瘤約占80%［11］，因其過(guò)量分泌胰島素可導(dǎo)致反復(fù)低血糖，甚至可引起腦細(xì)胞損傷。由于其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，臨床上極易誤診、誤治［4-5］，且目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大鼠胰島素瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞和人胰島素瘤細(xì)胞既表達(dá)胰島素，同時(shí)也表達(dá)胰高血糖素［9］。但關(guān)于胰高血糖素基因是否影響胰島素瘤形成的報(bào)道較少。有研究顯示，正常情況下，胰島α細(xì)胞對(duì)胰島β細(xì)胞的存活和胰島素分泌具有支持作用［12］，并且胰高血糖素對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖和胰島素分泌也有一定的促進(jìn)作用［13］。INS-1細(xì)胞系來(lái)自胰島β細(xì)胞經(jīng)過(guò)放射線照射誘導(dǎo)成的胰島β細(xì)胞瘤，具有胰島β細(xì)胞的絕大部分功能，可對(duì)葡萄糖刺激做出反應(yīng)而分泌大量胰島素。本研究結(jié)果顯示，INS-1細(xì)胞不僅表達(dá)胰島素而且表達(dá)胰高血糖素，與本課題組前期研究結(jié)果一致［9］。

為了進(jìn)一步探討胰高血糖素基因在胰島素瘤形成中的作用，本研究利用慢病毒介導(dǎo)的基因敲降系統(tǒng)建立了胰高血糖素敲降的INS-1細(xì)胞株。由于基因敲降所使用的載體pLVTHM不僅能在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)shRNA，而且表達(dá)GFP，因此本研究利用細(xì)胞表達(dá)GFP的情況初步判斷細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞免疫熒光染色、RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)的基因敲降系統(tǒng)可明顯降低INS-1細(xì)胞中胰高血糖素基因的表達(dá)水平，并且不隨細(xì)胞傳代和增殖而發(fā)生改變，說(shuō)明本研究成功構(gòu)建了穩(wěn)定敲降的胰高血糖素基因的INS-1細(xì)胞系。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲降胰高血糖素基因可降低INS-1細(xì)胞胰高血糖素的分泌，而對(duì)胰島素分泌功能無(wú)明顯影響，并且敲降胰高血糖素基因可明顯降低INS-1細(xì)胞的增殖能力，提示體外敲降胰高血糖素基因可抑制胰島素瘤細(xì)胞的增殖。之后，本研究利用本課題組前期已成功構(gòu)建的胰島素瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討胰高血糖素基因敲降在動(dòng)物整體水平上對(duì)胰島素瘤形成的影響［9］，該胰島素瘤模型具有臨床胰島素瘤的特點(diǎn)，適合用于對(duì)胰島素瘤的深入研究。

本研究結(jié)果顯示，與單純轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，移植敲降胰高血糖素基因細(xì)胞的裸鼠血糖下降較慢，形成的腫瘤體積也較小。移植瘤免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植組裸鼠移植瘤細(xì)胞胰島素的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，而胰高血糖素表達(dá)明顯降低，提示敲降胰高血糖素基因可在一定程度上抑制胰島素瘤細(xì)胞的增殖，使腫瘤體積較小，并且能減少胰島素的釋放，使裸鼠血糖下降較慢。筆者推測(cè)胰島素瘤的生長(zhǎng)可能與胰高血糖素基因表達(dá)水平有關(guān)。

Fig.7 Immunohistochemical staining of transplantation site after transplantation of knockdown of glucagon gene cells(×200)圖7 敲降胰高血糖素基因細(xì)胞移植后移植部位的免疫組化染色（×200）