李麗麗，焦富英

腦卒中是腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起的腦組織損傷，包括出血性和缺血性腦卒中。其中缺血性腦卒中占腦卒中患者的60%～80%，也是造成中老年人致殘和致死的主要疾?。?］。認(rèn)知功能障礙是腦卒中患者臨床最常見的功能障礙之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，我國腦卒中患者發(fā)病3個月內(nèi)發(fā)生認(rèn)知障礙的概率高達(dá)60%［2］。炎癥因子表達(dá)異常在缺血性腦卒中患者認(rèn)知功能障礙發(fā)展過程中有重要作用［3］，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）1/2/核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 - κB（nuclear transcription factors，NF-κB）通路是炎癥反應(yīng)中的重要信號通路。ERK1/2激活后可活化NF-κB，促使其轉(zhuǎn)移入核，進(jìn)而調(diào)控下游腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6等炎癥因子的表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)［4］。Li等［5］研究發(fā)現(xiàn)可樂定預(yù)處理可通過ERK1/2-CREB/NF-κB-NR2B途徑改善大鼠腦缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。鬼針草總黃酮（total flavones of bidens bipinnata L.，TFB）是鬼針草的主要生物活性成分。研究表明，TFB可減輕腦出血大鼠腦水腫和細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，改善血腫周圍組織微循環(huán)狀態(tài)，保護(hù)腦損傷［6］。TFB可抑制NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子的表達(dá)，提高抗氧化能力，減輕高氧所導(dǎo)致的大鼠肺損傷［7］。TFB能否改善腦缺血患者的認(rèn)知功能及可能的機(jī)制少見報道。本研究通過線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型，基于ERK1/2/NF-κB信號通路，探討TFB對腦缺血大鼠認(rèn)知功能的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8周齡健康雄性SD大鼠72只，清潔級，體質(zhì)量160～230 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0006。大鼠自由飲水和飲食，在溫度20～25℃、濕度50%～56%、光照12 h的環(huán)境空間中飼養(yǎng)。

1.2試劑 TFB購自合肥七星科技有限公司，總黃酮含量大于75%（批號：20180125）。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF，批號：20180125）和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF，批號：20180214）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；IL-1β（批號：20180215）、IL-6（批號：20180127）和TNF-α（批號：20180123）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠ERK1/2（貨號：sc-94）、p-ERK1/2（貨號：sc-7385）抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗小鼠NF-κB p65（貨號：6958）、p-NF-κB p65（貨號：6961）、β-actin兔抗大鼠（貨號：3700s）一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）的羊抗兔IgG二抗（貨號：C1309）購自美國Cell Signaling公司。

1.3實驗方法

1.3.1分組和給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、低劑量TFB組、中劑量TFB組、高劑量TFB組，每組12只。手術(shù)前，低、中、高劑量TFB組分別灌胃25、50、100 mg/kg的TFB［6］；陽性對照組灌胃1 mg/kg［8］的尼莫地平；假手術(shù)組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)治療7 d。手術(shù)后，繼續(xù)治療21 d。

1.3.2局灶性腦缺血大鼠模型建立 參照文獻(xiàn)［9］方法采用改良的線栓法建立局灶性腦缺血大鼠模型。大鼠腹腔注射10%水合甲醛，麻醉后，將大鼠仰臥式固定，從頸正中切口，暴露出頸總動脈（CCA）、右側(cè)頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）。從CCA分叉處結(jié)扎ECA，夾閉CCA近心端和遠(yuǎn)心端，在其近分叉處剪口，將線栓向ICA插入，直至大腦中動脈起始處，用來阻塞其開口。之后，收緊剪口處細(xì)線，松開CCA近心端動脈夾，逐層縫合。假手術(shù)組除不插入線栓外，其他操作相同。

1.3.3Morris水迷宮實驗 參照文獻(xiàn)［10］方法采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。Morris水迷宮實驗由定位航行實驗和空間探索實驗2部分組成。實驗開始前一天，將大鼠放入水中自由游泳2 min，熟悉環(huán)境。定位航行實驗：第1～5天觀察和記錄大鼠分別從4個象限入水后找到平臺的潛伏期。空間探索實驗：第6天撤去平臺，同一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s穿越平臺的次數(shù)。

1.3.4標(biāo)本采集和指標(biāo)檢測 Morris水迷宮實驗結(jié)束后第2天，從每組大鼠中采用簡單隨機(jī)抽樣法取6只，腹腔注射10%水合甲醛，麻醉后采用50 mL生理鹽水灌流沖凈體內(nèi)血液，4%多聚甲醛100 mL灌注固定，開顱取腦，待充分固定后取出海馬組織，4%中性甲醛固定7 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋，制作組織切片。切片行尼氏染色，觀察大鼠海馬組織病理結(jié)構(gòu)變化。其余大鼠取出海馬組織-80℃保存?zhèn)溆?。取適量海馬組織制成10%勻漿，ELISA檢測BDNF、NGF、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。具體操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 待上述實驗完成后，取適量海馬組織，加入RIPA裂解液于冰上充分裂解后離心（4℃、12 000 r/min，10 min）。取離心后的上清液，采用BCA法定量蛋白。蛋白溶液加入上樣緩沖液，95℃煮沸5 min，離心取上清液行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶37℃封閉2 h。TBST洗膜后加入稀釋好的一抗：ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體，以β-actin作為內(nèi)參，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗，37℃孵育2 h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液，避光顯影，曝光拍照。Image J圖像軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與相應(yīng)的β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮實驗結(jié)果 隨著訓(xùn)練時間的增加，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。在相同時間內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。從第2天起，與模型組比，陽性對照組和高劑量TFB組大鼠逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺次數(shù)顯著增加（P＜0.05）。與陽性對照組相比，高劑量TFB組大鼠平均逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2海馬組織尼氏染色 假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞呈圓形，染色均勻，細(xì)胞排列整齊。模型組細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，染色較深。不同劑量TFB干預(yù)后，海馬組織細(xì)胞形態(tài)、排列得到不同程度改善。高劑量TFB組海馬組織與假手術(shù)組較為接近，見圖1。

Tab.1 Results of Morris water maze experiment表1 Morris水迷宮實驗結(jié)果 （n=12，±s）

Tab.1 Results of Morris water maze experiment表1 Morris水迷宮實驗結(jié)果 （n=12，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與陽性對照組比較，d與低劑量TFB組比較，e與中劑量TFB組比較，P＜0.05；表2～4同

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量TFB組中劑量TFB組高劑量TFB組F逃避潛伏期（s）第1天36.58±5.24 62.41±5.49a 58.02±5.31 62.51±5.21c 60.24±5.43 59.43±5.19 109.499＊＊第2天31.24±5.57 59.24±5.37a 48.21±5.34b 58.43±5.08c 55.61±5.16 50.13±5.02bde 122.812＊＊第3天25.31±4.42 51.46±5.51a 37.61±5.24b 50.42±4.65c 44.61±4.72bd 38.46±4.83bde 123.573＊＊第4天18.34±4.47 44.43±5.12a 28.14±5.07b 42.63±5.31c 36.81±4.92bd 29.51±4.63bde 126.192＊＊第5天11.27±3.83 39.54±5.24a 19.36±4.16b 35.92±4.88c 29.15±4.31bd 20.53±4.25bde 182.911＊＊穿越平臺次數(shù)（次）6.94±1.21 2.17±0.53a 6.23±1.16b 2.68±0.57bc 4.51±0.82bd 6.25±1.14bde 141.271＊＊

Fig.1 Nissl staining of hippocampal tissues(×400)圖1 海馬組織尼氏染色（×400）

2.3大鼠海馬組織BDNF和NGF含量比較 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬組織BDNF和NGF含量均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量TFB組和陽性對照組大鼠海馬組織BDNF和NGF含量均顯著升高（P＜0.05）。高劑量TFB組和陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of BDNF and NGF contents in hippocampus between six groups表2 各組海馬組織BDNF和NGF含量比較（μg/L，n=6，±s）

Tab.2 Comparison of BDNF and NGF contents in hippocampus between six groups表2 各組海馬組織BDNF和NGF含量比較（μg/L，n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量TFB組中劑量TFB組高劑量TFB組F BDNF 0.62±0.13 0.21±0.04a 0.55±0.12b 0.24±0.03c 0.37±0.06bcd 0.53±0.09bde 64.404＊＊NGF 0.31±0.06 0.08±0.01a 0.27±0.03b 0.09±0.02c 0.18±0.03bcd 0.23±0.04bde 117.568＊＊

2.4海馬組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 與假手術(shù)組比，模型組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比，低、中、高劑量TFB組和陽性對照組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量均明顯降低，TFB具有劑量依賴性（P＜0.05）。高劑量TFB組和陽性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-α in hippocampus between six groups表3 海馬組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較（μg/L，n=6，±s）

Tab.3 Comparison of IL-1β,IL-6 and TNF-α in hippocampus between six groups表3 海馬組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較（μg/L，n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量TFB組中劑量TFB組高劑量TFB組F IL-1β 4.55±0.58 16.31±2.96a 6.07±0.98b 12.39±2.71bc 9.02±2.05bcd 5.24±0.73bde 96.080＊＊IL-6 6.31±0.75 25.24±3.29a 7.14±1.26b 22.15±3.22c 16.32±3.06bcd 8.05±1.43bd 193.434＊＊TNF-α 1.99±0.21 11.36±2.05a 3.08±0.46b 9.47±2.59c 6.83±1.29bcd 2.54±0.43bd 118.582＊＊

2.5ERK1/2/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組大鼠海馬組織ERK1/2、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與假手術(shù)組比，模型組大鼠海馬組織p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比，中、高劑量TFB組和陽性對照組大鼠海馬組織p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著降低，具有劑量依賴性（P＜0.05）。高劑量TFB組和陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2、表4。

Fig.2 ERK1/2/NF-κB pathway-related protein expression圖2 ERK1/2/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)

Tab.4 Expressions of ERK1/2/NF-κB pathway relatedproteins in six groups表4 ERK1/2/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá) （n=6，±s）

Tab.4 Expressions of ERK1/2/NF-κB pathway relatedproteins in six groups表4 ERK1/2/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá) （n=6，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性對照組低劑量TFB組中劑量TFB組高劑量TFB組F ERK1/2 0.65±0.21 0.86±0.25 0.67±0.18 0.74±0.16 0.71±0.21 0.68±0.17 0.881 p-ERK1/2 0.23±0.04 0.96±0.15a 0.31±0.06b 0.74±0.12c 0.49±0.08bcd 0.33±0.05bde 157.856＊＊NF-κB p65 0.72±0.21 0.85±0.18 0.73±0.22 0.82±0.19 0.79±0.16 0.75±0.18 0.445 p-NF-κB p65 0.17±0.03 0.84±0.19a 0.19±0.04b 0.78±0.16c 0.51±0.10bcd 0.20±0.05bde 122.126＊＊

3 討論

海馬是調(diào)控人類學(xué)習(xí)、記憶和情感等認(rèn)知功能的重要腦區(qū)，Morris水迷宮實驗是常用的測定大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的方法之一，潛伏期長短和穿越平臺次數(shù)可反映大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。BDNF是一種可促進(jìn)神經(jīng)元生長活性的蛋白質(zhì)，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，以海馬和皮質(zhì)含量最高。BDNF對維持神經(jīng)元功能、防治神經(jīng)元退行性病變、神經(jīng)元損傷后再修復(fù)等過程發(fā)揮重要作用，除此之外，其還參與大腦的學(xué)習(xí)和記憶過程［11］。因此，大鼠海馬組織BDNF水平降低也可在一定程度上反映其認(rèn)知功能受損程度。NGF是一種神經(jīng)生長因子，能有效拮抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的功能，誘導(dǎo)軸突末端生長，保護(hù)基底前腦膽堿能神經(jīng)元受損導(dǎo)致的神經(jīng)變性，改善空間學(xué)習(xí)記憶能力［12］。研究表明，海馬齒狀回中BDNF和NGF表達(dá)水平與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，成年大鼠認(rèn)知功能降低與海馬組織BDNF和NGF表達(dá)水平降低有關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠平均潛伏期較假手術(shù)組顯著升高，穿越平臺次數(shù)減少，海馬組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核固縮，BDNF和NGF表達(dá)水平降低，說明模型建立成功，局灶性腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙。TFB可縮短大鼠平均潛伏期，增加穿越平臺次數(shù)，促進(jìn)BDNF和NGF表達(dá)，提示TFB可改善局灶性腦缺血大鼠的認(rèn)知功能。

ERK1/2是真核細(xì)胞中廣泛存在的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，ERK1/2信號的激活可促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)。同時，NF-κB還是ERK信號傳導(dǎo)通路的下游調(diào)控分子，活性受ERK1/2的調(diào)控。ERK1/2的活化可進(jìn)一步激活NF-κB，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生。還有研究報道顯示，NGF能夠通過激活ERK1/2信號通路抑制凋亡的產(chǎn)生，同時在細(xì)胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)激活ERK有利于細(xì)胞抵抗損傷而產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，其具體機(jī)制可能與激活Bga-1及Bcl-2等有關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較假手術(shù)組升高，此結(jié)果說明局灶性腦缺血可能刺激p-ERK1/2相關(guān)信號通路激活，促使BDNF及NGF水平下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能改變，損害認(rèn)知功能，而TFB能夠抑制p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)，從而促使BDNF及NGF水平增高，最終改善認(rèn)知功能的。NF-κB通過磷酸化被激活后，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子家族，包含p65、p50等多個亞單位，而IL-1β、TNF-α等多種炎癥因子可促進(jìn)腦組織中NF-κB激活，而活化的NF-κB則將會進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α等炎癥因子大量生成，從而導(dǎo)致組織過度炎癥反應(yīng)及損傷。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠海馬組織促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α與p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)具有相同的變化情況，此結(jié)果與有關(guān)研究結(jié)果基本一致［15］，進(jìn)一步說明TFB可能通過ERK1/2/NF-κB信號通路傳導(dǎo)，降低局灶性腦缺血大鼠大腦炎癥反應(yīng)，提示TFB對腦保護(hù)具有一定的作用。

綜上所述，TFB提高局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能，促進(jìn)海馬組織BDNF和NGF表達(dá)水平，改善大鼠認(rèn)知功能，其作用機(jī)制可能與抑制ERK1/2/NF-κB信號通路傳導(dǎo)，降低IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的表達(dá)有關(guān)。