馬鐵軍，任利，王燕德

胃癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的重要原因。胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，探索胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，對(duì)胃癌的早期診斷、治療、預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和評(píng)估預(yù)后具有重大意義[1]。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療逐漸成為胃癌治療的新途徑。微小RNA(microRNA，miRNA)是細(xì)胞間重要的信息交流介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其參與胃癌發(fā)生、發(fā)展，腹膜轉(zhuǎn)移等，可作為胃癌診斷的新生標(biāo)志物及治療的潛在靶標(biāo)[2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-204在胃癌組織以及胃癌細(xì)胞株中低表達(dá)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分化程度有關(guān)，miR-204過表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并能促進(jìn)其細(xì)胞凋亡[3]。miR-204-5p通過下調(diào)USP47與RAB22A的表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抑癌基因功能[4]。miR-204-5p在人結(jié)直腸癌中也低表達(dá)，且能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)[5]。鋅指E盒增強(qiáng)子結(jié)合蛋白1(zinc-finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)是E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，影響細(xì)胞的粘附性和移動(dòng)性，調(diào)節(jié)EMT進(jìn)展；干擾ZEB1的表達(dá)能降低胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，增高E-cadherin的表達(dá)[6]。但miR-204-5p對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及miR-204-5p是否通過ZEB1影響胃癌細(xì)胞侵襲和遷移還尚未可知，本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-204-5p對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及miR-204-5p是否通過ZEB1影響胃癌細(xì)胞侵襲和遷移。

1 材料與方法

1.1 材料

胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、MGC-803和正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；MTT試劑盒、DMSO、BCA試劑盒、PBS緩沖液購(gòu)自Sigma公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901、MGC-803和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2天換液一次，待細(xì)胞融和至80%左右時(shí)，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取常規(guī)培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合，更換為無血清培養(yǎng)基同步化12 h，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為miR-con組(轉(zhuǎn)染miR-con)、miR-204-5p組(轉(zhuǎn)染miR-204-5p mimics)、si-con組(轉(zhuǎn)染si-con)、si-ZEB1組(轉(zhuǎn)染si-ZEB1)、anti-miR-con組(轉(zhuǎn)染anti-miR-con)、anti-miR-204-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-204-5p)、miR-204-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-204-5p和pcDNA)、miR-204-5p+ pcDNA-ZEB1組(共轉(zhuǎn)染miR-204-5p和pcDNA-ZEB1)，轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-204-5p和ZEB1 mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4 ℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和β-actin條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 在各組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)加入20 μL(5 g/L)的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h；棄去多余培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO振蕩反應(yīng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞活性(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 在各組細(xì)胞，胰酶消化后使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×104個(gè)/mL。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室中，并置于含完全培養(yǎng)基的下室中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，取出小室，去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞，PBS洗滌，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)算結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：以1∶5比例加入RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后，鋪于Transwell小室的上室，室溫下干燥后，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作。最后顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-204-5p對(duì)ZEB1的靶向調(diào)控 TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示ZEB1 3′UTR區(qū)域有miR-204-5p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)ZEB1的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(ZEB1-WT和ZEB1-MUT)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用LipofectamineTM2000將ZEB1-WT和ZEB1-MUT組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-con和miR-204-5p。依據(jù)說明書要求，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-204-5p和ZEB1在人胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901、MGC-803中miR-204-5p的表達(dá)水平顯著降低，ZEB1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖1，表1)顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901、MGC-803中ZEB1蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

2.2 過表達(dá)miR-204-5p對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，與miR-con組相比，miR-204-5p組胃癌細(xì)胞中miR-204-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖2B，表3)顯示，與miR-con組相比，miR-204-5p組胃癌細(xì)胞中MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，與miR-con組相比，miR-204-5p組胃癌細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測(cè)結(jié)果(圖2A，表2)顯示，與miR-con組相比，miR-204-5p組胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

圖1 ZEB1蛋白表達(dá)

分組miR-204-5pZEB1 mRNAZEB1 蛋白GES-11.01±0.101.02±0.110.24±0.06AGS0.36±0.06①4.22±0.34①0.80±0.04①SGC-79010.27±0.05①5.16±0.41①0.85±0.07①M(fèi)GC-8030.38±0.03①5.18±0.36①0.87±0.05①F值244.871327.862259.619P值0.0000.0000.000

注：與GES-1組比較，①P<0.05

圖2胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)以及增殖、遷移相關(guān)蛋白表達(dá) A：Transwell檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞侵襲、遷移的細(xì)胞數(shù)；放大倍數(shù)200×; B：Western blot檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 過表達(dá)miR-204-5p對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響

表3 miR-204-5p模擬物對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 miR-204-5p靶向調(diào)控ZEB1的表達(dá)

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)到ZEB1與miR-204-5p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖3A)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，轉(zhuǎn)染野生型ZEB1基因表達(dá)載體ZEB1-WT后，相較于miR-con組，miR-204-5p組ZEB1-WT胃癌細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型ZEB1基因表達(dá)載體ZEB1-MUT后，相較于miR-con組，miR-204-5p組ZEB1-MUT胃癌細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖3B，表5)顯示，相較于miR-con組，miR-204-5p組胃癌細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)水平顯著降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-204-5p組胃癌細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

圖3ZEB1的3′UTR中含有與miR-204-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.4 抑制ZEB1表達(dá)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的影響

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-204-5p調(diào)控ZEB1蛋白的表達(dá)

注：與miR-con組比較，①P<0.05；與anti-miR-con組比較，②P<0.05

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖4，表7)顯示，與si-con組相比，si-ZEB1組胃癌細(xì)胞中ZEB1、MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表6)顯示，與si-con組相比，si-ZEB1組胃癌細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測(cè)結(jié)果(圖2A，表2)顯示，與si-con組相比，si-ZEB1組胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低(P<0.05)。

2.5 過表達(dá)ZEB1逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-204-5p對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及EMT的作用

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖5，表9)顯示，與miR-204-5p+pcDNA組相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1組胃癌細(xì)胞中ZEB1、MMP-2、Cyclin D1、Vimentin蛋白的表達(dá)水平顯著升高，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。MTT法檢測(cè)結(jié)果(表8)顯示，與miR-204-5p+pcDNA組相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1組胃癌細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)。Transwell 法檢測(cè)結(jié)果(表8)顯示，與miR-204-5p+pcDNA組相比，miR-204-5p+pcDNA-ZEB1組胃癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05)。

圖4 檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

分組細(xì)胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h細(xì)胞侵襲數(shù)量細(xì)胞遷移數(shù)量si-con0.35±0.040.68±0.050.89±0.0767.29±6.98156.29±11.39si-ZEB10.33±0.030.43±0.040.53±0.0633.26±5.0276.22±7.06t值1.20011.71311.71411.87417.925P值0.2480.0000.0000.0000.000

表7 抑制ZEB1表達(dá)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移及EMT相關(guān)蛋白的作用

圖5 檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

分組細(xì)胞活性(OD490 nm)24 h48 h72 h細(xì)胞侵襲數(shù)量細(xì)胞遷移數(shù)量miR-con0.38±0.040.73±0.070.88±0.0865.59±5.39135.33±11.29miR-204-5p0.36±0.020.42±0.05①0.61±0.07①25.36±3.95①70.37±6.59①miR-204-5p+pcDNA0.35±0.030.41±0.040.60±0.0525.29±3.1968.26±7.02miR-204-5p+ pcDNA-ZEB10.37±0.040.68±0.05②0.79±0.06②62.59±5.22②120.36±8.64②F值1.33389.11339.310220.357144.088P值0.2810.0000.0000.0000.000

注：與miR-con組比較，①P<0.05；與miR-204-5p+pcDNA組比較，②P<0.05

表9 miR-204-5p和ZEB1表達(dá)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移、EMT相關(guān)蛋白的作用

注：與miR-con組比較，①P<0.05；與miR-204-5p+pcDNA組比較，②P<0.05

3 討論

胃癌是全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，因其異質(zhì)性強(qiáng)，惡性度高導(dǎo)致預(yù)后差，嚴(yán)重影響人類身體和生命健康[7]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)控胃癌相關(guān)的調(diào)控基因或mRNA，可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。如miR-204-5p通過靶向調(diào)控Six1可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲[9]；miR-204-5p在結(jié)直腸癌組織中下調(diào)表達(dá)，恢復(fù)miR-204-5p表達(dá)通過下調(diào)RAB22A抑制了結(jié)直腸癌的遷移和侵襲[10]；miR-204-5p同樣可以通過抑制RAB22A抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[11]。miR-204-5p還通過抑制FOXC1表達(dá)抑制喉鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，miR-204-5p在胃癌細(xì)胞中也低表達(dá)，過表達(dá)miR-204-5p可抑制S胃癌GC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲；且miR-204-5p靶向調(diào)控ZEB1的表達(dá)。

ZEB1是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員，研究發(fā)現(xiàn)ZEB1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力[13]。ZEB1高表達(dá)的胃癌患者會(huì)顯示出較短的總生存期和無病生存期、較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[14]。miR-431通過抑制ZEB1介導(dǎo)的EMT抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]。miR-1271也通過靶向ZEB1和TWIST1抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移，侵襲和EMT[16]。本研究結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞中ZEB1高表達(dá)，抑制ZEB1表達(dá)可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。且ZEB1受miR-204-5p的靶向調(diào)控，過表達(dá)ZEB1能逆轉(zhuǎn)miR-204-5p對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

EMT是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。細(xì)胞表面蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞骨架蛋白波形蛋白(Vimentin)、轉(zhuǎn)化因子ZEB1等是EMT的相關(guān)生物標(biāo)志物，在EMT過程中，E-cadherin功能喪失，Vimentin及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表達(dá)水平上調(diào)；Zeb家族的異常高表達(dá)經(jīng)促進(jìn)EMT而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[18]。在上皮性卵巢癌中，ZEB1表達(dá)增加時(shí)，E-cadherin表達(dá)下降，而Vimentin表達(dá)上升，提示ZEB1可能通過調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌中E-cadherin及Vimentin的表達(dá)參與了EMT過程[19]。Vimentin在胃癌中高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)，其通過EMT參與胃癌淋巴轉(zhuǎn)移[20]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-204-5p和抑制ZEB1表達(dá)均抑制MMP-2、Vimentin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)。提示miR-204-5p和ZEB1通過影響Vimentin和E-cadherin表達(dá)影響EMT過程進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-204-5p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控ZEB1和EMT有關(guān)，將可為胃癌的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn)。