胡松，周文杰，徐天天，張文滔

胰腺癌是一種發(fā)病率較高的高度致命性疾病。由于其早期癥狀不明顯，又缺乏有效的早期檢測方法，大多數(shù)患者就診時已處于胰腺癌晚期，導(dǎo)致只有少數(shù)患者可進(jìn)行切除手術(shù)。因此，尋找鑒定胰腺癌的分子標(biāo)志物，開發(fā)新的有效的治療方法迫在眉睫。miRNA是一類可參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的短鏈非編碼RNA，在胰腺癌中異常表達(dá)miRNA的通過調(diào)控其下游基因的表達(dá)，參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[1-3]。有研究報道m(xù)iR-145-5p在前列腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-145-5p可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[4]。此外，miR-145-5p在乳腺癌增殖中也處于較低的表達(dá)水平，且miR-145-5p可靶向作用于SOX2發(fā)揮生物學(xué)作用[5]。前人研究發(fā)現(xiàn)，miR-145-5p在胰腺癌患者血漿中表達(dá)下調(diào)，但miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響尚未可知[6]。磷脂酶Cε1 (phospholipase C epsilon-1,PLCE1)基因編碼的PLCE1蛋白是磷脂酰肌醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)控酶，參與對細(xì)胞生長、分化和凋亡等生命活動的的調(diào)控[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8-9]，PLCE1在食管癌組織中呈高表達(dá)，沉默PLCE1可促進(jìn)食管癌細(xì)胞Eca109的自噬和凋亡。然而，PLCE1在胰腺癌中的表達(dá)情況，且miR-145-5p能否靶向PLCE1參與對胰腺癌增殖、分化和凋亡的調(diào)控尚不清楚。因此，本研究通過檢測常胰腺細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中miR-145-5p和PLCE1的表達(dá)，觀察過表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，探究miR-145-5p對PLCE1的靶向作用機(jī)制，以期為胰腺癌的早期診斷和分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

胰腺癌細(xì)胞PANC-1、SW1990、Capan-1、Capan-2和正常胰腺細(xì)胞hTERT-HPNE均購于美國ATCC。高糖DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購于Thermo公司；FBS購于杭州四季青公司；青鏈霉素雙抗購于HyClone公司；LipofectamineTM2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購于Invitrogen公司；MTT試劑、DMSO、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液和Western blot相關(guān)試劑均購于上海碧云天生物技術(shù)公司；PLCE1、CyclinD1、Bcl-2、SOX2、OCT-4和FOXA2抗體購于Abcam公司；β-actin、Bax抗體購于Santa Cruz公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組

hTERT-HPNE細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，SW1990、Capan-1和Capan-2細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，PANC-1細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基中均含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，并放置于37 ℃、飽和濕度和含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期PANC-1細(xì)胞，以每孔2×105個細(xì)胞數(shù)接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時，按照LipofectamineTM2000使用說明書將miR-145-5p、miR-con和NC分別轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。為了進(jìn)一步驗證miR-145-5p是通過下調(diào)PLCE1表達(dá)影響PANC-1細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在PANC-1細(xì)胞同時轉(zhuǎn)入miR-145-5p模擬物和pcDNA-PLCE1，檢測過表達(dá)PLCE1能否逆轉(zhuǎn)miR-145-5p對PANC-1細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響。實驗分組如下：NC組(空白對照)、miR-con組(陰性對照)、miR-145-5p組(轉(zhuǎn)染miR-145-5p)、miR-145-5p+pcDNA-con組(miR-145-5p和pcDNA-con共轉(zhuǎn)染)和miR-145-5p+pcDNA-PLCE1組(miR-145-5p和pcDNA-PLCE1共轉(zhuǎn)染)。

1.3 qRT-PCR檢測

依照TRIzol試劑使用說明分別提取hTERT-HPNE、SW1990、Capan-1、Capan-2和各組PANC-1細(xì)胞的總RNA，用Nanodrop 2000檢測其濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。分別以以U6和β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miR-145-5p和PLCE1 mRNA的相對表達(dá)量。實驗所用引物序列如下：miR-145-5p-F：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；miR-145-5p-R：5′-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3′；U6-F：5′-GCTTCGGCAGCACA-TATACTAAAAT-3′；U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-CAT-3′；PLCE1-F：5′-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3′；PLCE1-R：5′-AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3′；β-actin-F：5′-CTCCA-TCCTGGCCTCGCTGT-3′；β-actin-R：5′-GCTGTCACCTTCACC-GTTCC-3′。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力

分別于轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h和72 h各取一組PANC-1細(xì)胞，加入20 μL/孔的MTT試劑在培養(yǎng)箱中孵育約4 h，小心吸去孔內(nèi)上清后，再加入150 μL/孔的DMSO試劑繼續(xù)孵育2 h至結(jié)晶完全溶解。利用酶聯(lián)免疫吸附儀，在490 nm波長，測量各孔的OD值(用空白孔進(jìn)行調(diào)零)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用胰酶(不含EDTA)消化處理各組PANC-1細(xì)胞，將各組PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移至EP管中，1 000 rpm離心5 min，然后收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，離心棄去上清液。用100 μL的1×的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI進(jìn)行染色并混勻，避光室溫孵育15 min，測試前補(bǔ)加400 μL的1×結(jié)合緩沖液后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測增殖、分化、和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用RIPA裂解液裂解各組PANC-1細(xì)胞，收集各組細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品沸水浴3～5 min充分變性后，取30 μg已冷卻至室溫的變性蛋白上樣到SDS-PAGE膠加樣孔，設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，利用轉(zhuǎn)膜裝置將已分離的細(xì)胞蛋白從PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用Western blot洗滌液漂洗1～2 min，然后用Western blot封閉液側(cè)擺搖床室溫封閉60 min，吸盡封閉液后立即加入已稀釋的抗PLCE1、β-actin、CyclinD1、Bax、Bcl-2、SOX2、OCT-4和FOXA2蛋白的一抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h后，回收一抗后，將已漂洗后的PVDF膜中加入已稀釋的二抗(1∶500)，室溫孵育1 h，回收二抗后，用Western blot洗滌液進(jìn)行洗膜，共洗3次，每次5 min，然后進(jìn)行ECL顯色、洗片，并以β-actin為內(nèi)參對目的條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Target Scan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-145-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-145-5p的5′端可與PLCE1 mRNA的3′-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，猜測PLCE1是miR-145-5p的靶基因。為驗證這一猜想，構(gòu)建含有miR-145-5p結(jié)合位點的PLCE1-3′UTR野生型(WT-PLCE1)及突變型(MUT-PLCE1)熒光素酶報告基因載體。利用LipofectamineTM2000將miR-145-5p和miR-con分別與WT-MDM2和MUT-MDM2共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，然后將各組PANC-1細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，并利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組PANC-1細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-145-5p和PLCE1在正常胰腺細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

表1和圖1結(jié)果顯示，與hTERT-HPNE細(xì)胞相比，PANC-1、SW1990、Capan-1和Capan-2細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá)顯著降低，PLCE1 mRNA和PLCE1蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明，在胰腺癌細(xì)胞中miR-145-5p呈低表達(dá)，PLCE1呈高表達(dá)。

圖1 Western blot檢測PLCE1蛋白表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖和分化的影響

表2結(jié)果顯示，與NC組和miR-con組比較，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-145-5p的PANC-1細(xì)胞株。圖2、表2和表3結(jié)果顯示，與NC組和miR-con組比較，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞在0 h和24 h時的細(xì)胞活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時細(xì)胞活力顯著減弱，CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表達(dá)顯著降低，F(xiàn)OXA2蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。表明，過表達(dá)miR-145-5p可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的分化。

表1 用檢測胰腺癌細(xì)胞和正常胰腺細(xì)胞系中miR-145-5p、PLCE1表達(dá)量

注：與hTERT-HPNE細(xì)胞組比較，*P<0.05

圖2Western blot檢測CyclinD1 SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白的表達(dá)

表2 高表達(dá)miR-145-5p對PANC-1胰腺癌細(xì)胞系增殖的影響

注：與miR-145-5p組比較，*P<0.05

表3 Western blot檢測SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白表達(dá)

注：與miR-145-5p組比較，*P<0.05

2.3 過表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡的影響

圖3和表4結(jié)果顯示，與NC組和miR-con組比較，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞的凋亡率顯著增加，Bax蛋白的表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.05)。表明，過表達(dá)miR-145-5p可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。

2.4 miR-145-5p靶向調(diào)控PLCE1表達(dá)

圖4A顯示，miR-145-5p的5′端可與WT-PLCE1 mRNA的3′UTR區(qū)域存在特異性結(jié)合位點。表5結(jié)果顯示，野生型PLCE1基因熒光素酶表達(dá)載體WT-PLCE1和miR-145-5p模擬物共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組明顯降低(P<0.05)；而突變型PLCE1基因熒光素酶表達(dá)載體MUT-PLCE1和miR-145-5p模擬物共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞熒光素酶活性較miR-con組差異不顯著(P>0.05)。表6和圖4B結(jié)果顯示，與miR-con組比較，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞PLCE1蛋白的表達(dá)量顯著減低；與anti-miR-con組比較，anti-miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞PLCE1蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。提示，PLCE1是miR-145-5p的靶基因，miR-145-5p可負(fù)性調(diào)控PLCE1的表達(dá)。

圖3高表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1凋亡的影響研究 A：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測Bax、Bcl-2的蛋白

表4 高表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1凋亡的影響研究

注：與miR-145-5p組比較，*P<0.05

圖4miR-145-5p靶向調(diào)控PLCE1表達(dá) A：通過TargetScan對miR-145-5p和PLCE1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖；B：Western blot檢測PLCE1蛋白表達(dá)

表5 miR-con或miR-145-5p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

注：與miR-con組比較，*P<0.05

2.5 過表達(dá)PLCE1可部分恢復(fù)過表達(dá)miR-145-5p對PANC-1細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響

圖5、表7和表8結(jié)果顯示，與miR-con組相比，miR-145-5p組PANC-1細(xì)胞在0 h和24 h時的細(xì)胞活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時細(xì)胞活力顯著減弱，細(xì)胞的凋亡率顯著增加，PLCE1、Bcl-2、CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表達(dá)顯著降低，Bax和FOXA2蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與miR-145-5p+pcDNA-con組相比，miR-145-5p+pcDNA-

表6 Western Blot檢測PLCE1的表達(dá)

注：與miR-con比較，*P<0.05；與anti-miR-con組比較，#P<0.05

PLCE1組PANC-1細(xì)胞在0 h和24 h時的細(xì)胞活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h時細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞的凋亡率顯著降低，PLCE1、Bcl-2、CyclinD1、SOX2和OCT-4蛋白的表達(dá)顯著升高，Bax和FOXA2蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)PLCE1可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖抑制、分化和凋亡促進(jìn)作用。

圖5過表達(dá)PLCE1部分恢復(fù)miR-145-5p高表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1分化、增殖、凋亡的影響 A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B Western Blot檢測PLCE1、Bax、Bcl-2、CyclinD1、SOX2、OCT-4、FOXA2蛋白表達(dá)

表7 WB檢測PLCE1、Bax、Bcl-2、SOX2、OCT-4、FOXA2 相關(guān)蛋白的表達(dá)

注：與miR-con組比較，*P<0.05；與miR-145-5p+pcDNA-con組比較，#P<0.05

表8 過表達(dá)PLCE1部分恢復(fù)過表達(dá)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞系PANC-1增殖、凋亡的影響

注：與miR-con組比較，*P<0.05；與miR-145-5p+pcDNA-con組比較，#P<0.05

3 討論

近年來，越來越多的研究證實，miRNA通過調(diào)控其下游靶基因而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，miRNA的異常表達(dá)與人類多種癌癥的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展密切相關(guān)[10]。其中，miR-145在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。例如，miR-145通過靶向MUC1下調(diào)E-cad表達(dá)，從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[11]；miR-145-5p通過靶向TAGLN2抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。此外，miR-145-5p還可通過靶向下調(diào)KLF5促進(jìn)胃癌分化[13]。但miR-145-5p對對胰腺癌細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響尚未可知。本研究首先對正常胰腺細(xì)胞和4種胰腺癌細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá)顯著下調(diào)，這與楊立濤等人[6]的研究結(jié)果相吻合，推測miR-145-5p與胰腺癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有關(guān)。隨后以胰腺癌細(xì)胞PANC-1為研究對象，成功構(gòu)建過表達(dá)miR-145-5p的胰腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)PANC-1細(xì)胞的增殖活力顯著減弱，凋亡率顯著增加。SOX-2(Y染色體上的性別決定區(qū)盒2)、OCT-4(八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4)和FOXA-2(叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子A2)是反映癌細(xì)胞分化程度的常用指標(biāo)[14]。有研究[15]報道，SOX-2和OCT-4蛋白在癌旁組織和良性腫瘤中不表達(dá)，與高分化腫瘤相比，低分化腫瘤中更易檢測到高度表達(dá)的SOX-2和OCT-4蛋白。FOXA-2高表達(dá)則可通過提高組蛋白乙?；竭M(jìn)而誘導(dǎo)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化[16]。本研究將SOX-2、OCT-4和FOXA-2作為反映胰腺癌分化程度的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-145-5p可抑制SOX-2和OCT-4蛋白的表達(dá)，促進(jìn)FOXA-2蛋白的表達(dá)。提示，過表達(dá)miR-145-5p可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的分化和凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

PLCE1基因位于10號染色體q23.32～24.1位置，其編碼的PLCE1蛋白屬于磷脂酶C家族，即可被上游信號Ras家族GTP酶和G蛋白進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)，還可引起鈣離子流動、激活蛋白激酶C和作為GMP交換因子，參與對細(xì)胞增殖、分化和侵襲等生物學(xué)過程的調(diào)控[17]。雖然對PLCE1已進(jìn)行廣泛的研究，但其在人類癌癥中的作用仍存在爭議。在結(jié)直腸癌、肺癌和皮膚癌等Ras引發(fā)的癌癥中PLCE1呈低表達(dá)，并發(fā)揮抑癌作用[18]。然而，在膀胱癌和食管癌等癌癥中PLCE1具有癌基因的作用，干擾PLCE1表達(dá)降低了膀胱癌T24細(xì)胞株的侵襲能力,miR-145通過靶向下調(diào)PLCE1抑制食管鱗癌的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[19-20]。但其在胰腺癌中的生物學(xué)功能還有待進(jìn)一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常胰腺細(xì)胞相比，4種胰腺癌細(xì)胞中PLCE1的表達(dá)顯著上調(diào)。此外，本研究首次用雙熒光素酶報告基因和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)miR-145-5p通過靶向下調(diào)PLCE1表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有關(guān)。為了進(jìn)一步驗證miR-145-5p通過靶向PLCE1參與對胰腺癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡的調(diào)控，進(jìn)行功能回復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PLCE1可逆轉(zhuǎn)miR-145-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖抑制、分化和凋亡促進(jìn)作用。提示，miR-145-5p是通過調(diào)控PLCE1表達(dá)發(fā)揮作用，因此推斷miR-145-5p通過靶向下調(diào)PLCE1抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，遏制胰腺癌的惡性發(fā)展。

綜上所述，miR-145-5p在胰腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，PLCE1呈高表達(dá)，上調(diào)miR-145-5p通過靶向下調(diào)PLCE1可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。因此，miR-145-5p有望成為胰腺癌早期診斷和分子治療的潛在靶點。