王圓圓， 劉慧銘， 梁露群， 張會芳， 向珈誼， 郭兵

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室， 貴州 貴陽 550025； 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smads信號通路介導(dǎo)的腎小管間質(zhì)纖維化病變是糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)的重要發(fā)病機制[1]，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄共抑制因子(ski-related novel protein N，SnoN)作為TGF-β1/Smads信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在 DN發(fā)生發(fā)展過程中蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且隨病程進(jìn)展遞減[2-3]。有研究表明，肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)作為一種內(nèi)源性腎臟保護(hù)因子，能有效抗纖維化，在不同類型腎臟細(xì)胞中可通過不同的機制抑制TGF-β1/Smads通路效應(yīng)，從而延緩或減輕慢性腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展[4]；也有研究表明，無論是HGF單一刺激或是與TGF-β1共同處理人腎小管上皮細(xì)胞，均能上調(diào)SnoN的蛋白表達(dá)，提示HGF可通過活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase-1 and -2，ERK1/2)上調(diào)SnoN在基因水平的表達(dá)[5-6]。因此，本研究通過觀察外源性HGF對高糖條件下的大鼠腎小管上皮細(xì)胞纖維化病變、SnoN表達(dá)及ERK1/2活化的影響，探討HGF抗纖維化的作用靶點及可能機制，為治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要材料與試劑

大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E由上海復(fù)旦大學(xué)陸利民教授惠贈，人重組HGF(human recombinant HGF，rhHGF)購自美國Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco Introvagen公司，低糖DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，Mouse-anti-α-平滑肌肌動蛋白(α-sooth muscle actin, α-SMA)、Rabbit-anti-膠原蛋白Ⅲ(CollagenⅢ,Col-Ⅲ)、Rabbit-anti-ERK1/2(bs-2637R)、Rabbit-anti-Phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(p-ERK1/2)多克隆抗體購自中國博奧森生物技術(shù)有限公司，Mouse-anti-β-actin單克隆抗體和DAB顯色劑購自中國博士德生物技術(shù)有限公司，Rabbit-anti-SnoN(sc-9141)和Rabbit-anti-鈣黏蛋白(E-cadherin)購自美國Santa Cruz公司。生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(BA1003) 、生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(BA1001)]和兩步法免疫組化檢測試劑購自中國中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Western印跡用PVDF(polyvinylidene fluoride)膜和3MMWhatman濾紙購自美國Millipor公司，Goat-anti-Rabbit FITC、Goat-anti-Mouse Tex-red及4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)和超敏ECL(electrochemiluminescence)化學(xué)發(fā)光試劑盒購自中國碧云天生物研究所，總RNA提取試劑盒(TRIzol法)購自中國天根生化科技有限公司，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Fermentas公司， iQTMSYBR? Green Supermix購自美國Bio-rad公司。OLYMPUS-DP72倒置熒光顯微鏡購自美國OLYMPUS公司，其它試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1主要溶液的配置 rhHGF母液為用無菌去離子水配置凍干粉使其濃度為10 mg/L，混勻標(biāo)記好日期和濃度，-20 ℃儲存。2% FBS正常糖培養(yǎng)液(5.5 mmol/L glucose)為低糖DMEM培養(yǎng)基245 mL和滅活FBS 5 mL混入無菌鹽水瓶中即得；2% FBS高糖培養(yǎng)液(5.5 mmol/L glucose加入19.5 mmol/LD-glucose)系19.5 mmol/LD-glucose 0.878 3 g，溶于245 mL低糖DMEM培養(yǎng)基，用0.22 μm濾器過濾除菌后，加入滅活FBS 5 mL混入無菌鹽水瓶中即得；rhHGF高糖細(xì)胞培養(yǎng)液為分別取復(fù)溫融化的rhHGF母液50、100 μL于50 mL高糖培養(yǎng)液配置終濃度為10、20 μg/L，吹打混勻，4 ℃保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將生長狀態(tài)良好、融合度達(dá)到80%～90%的NRK-52E細(xì)胞加入低糖DMEM，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱16 h，使細(xì)胞同步化生長。將細(xì)胞分為對照組(NG組，給予正常糖培養(yǎng)液培養(yǎng))、高糖對照組(HG組，給予高糖培養(yǎng)液培養(yǎng))、10 μg/L rhHGF干預(yù)組(低劑量rhHGF組，給予10 μg/L rhHGF高糖培養(yǎng)液培養(yǎng))及20 μg/L rhHGF干預(yù)組(高劑量rhHGF組，給予20 μg/L rhHGF高糖培養(yǎng)液培養(yǎng))，每組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3免疫熒光染色 用免疫熒光間接染色法分別檢測E-cadherin(1 ∶200)、α-SMA (1 ∶100)在NRK-52細(xì)胞的表達(dá)和分布，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，OLYMPUS-DP72倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.4Western blot檢測 各組細(xì)胞加裂解液裂解，分別提取蛋白，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，目的蛋白Ⅰ抗如下：SnoN(1 ∶200)、ERK1/2(1 ∶400)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(1 ∶300)、E-cadherin (1 ∶200)、α-SMA(1 ∶150)、Col-Ⅲ(1 ∶200)、β-actin(1 ∶400)，檢測各目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5Real-time PCR檢測 TRIzol一步法提取各組細(xì)胞的總RNA，核酸蛋白儀測RNA的濃度和純度(A260/A280在1.8～2.1)，取1 μg腎組織總RNA按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆脤⒎崔D(zhuǎn)錄的 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴增，管家基因 β-actin做內(nèi)參。SnoN上游引物 5′-CCATTCAATGCCCCATCCT-3′，下游引物 5′-AGTTCGTGGCCGCAATAAAG-3′，擴增產(chǎn)物大小為81 bp；β-actin上游引物 5′-GCCAACACAGTGCTGTCT-3′，下游引物 5′-AGGAGCAAT-GATCTTGATCTT-3′，擴增產(chǎn)物大小為 114 bp。將反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 行熒光定量 PCR，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s、55 ℃退火40 s，擴增 45 個循環(huán)后收集數(shù)據(jù)，繪制動力學(xué)曲線讀取 Ct值。將各組目的基因的Ct值與管家基因的Ct值相減得△Ct，擴增重復(fù) 3 次，計算出各組mRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NRK-52E細(xì)胞形態(tài)

正常糖培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞E-cadherin高表達(dá)，幾乎無α-SMA蛋白陽性染色；高糖培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增多，見圖1。

圖1 不同環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞的E-cadherin、α-SMA表達(dá)(免疫熒光染色，×1 000)

2.2 NRK-52E細(xì)胞E-cadherin、α-SMA及Col-Ⅲ蛋白表達(dá)

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組NRK-52E細(xì)胞中α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與HG組比較，在rhHGF干預(yù)組，10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使NRK-52E細(xì)胞α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)減少，E-cadherin蛋白表達(dá)增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與NG組同指標(biāo)比較，P<0.05；(2)與HG組同指標(biāo)比較，P<0.05；(3)與低劑量rhHGF組同指標(biāo)比較，P<0.05。

2.3 NRK-52E細(xì)胞SnoN表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與NG組相較，HG組細(xì)胞中SnoN蛋白的表達(dá)減少(P<0.05)；而與HG組相較，在rhHGF干預(yù)組，10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使SnoN蛋白的表達(dá)增多(P<0.05)，見圖3。Real-time PCR檢測SnoNmRNA可見，與NG組相較，HG組SnoNmRNA表達(dá)增加，而與HG組相較，在rhHGF干預(yù)組, 10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使SnoNmRNA的表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.05)，見圖4。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

2.4 HGF對高糖培養(yǎng)下NRK-52E細(xì)胞ERK1/2活化的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NG組相較，高糖上調(diào)NRK-52E細(xì)胞中p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)蛋白表達(dá)(P<0.05)，總ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與HG組相比，在rhHGF干預(yù)組, 10 μg/L或20 μg/L rhHGF均可使進(jìn)一步上調(diào)p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

注：(1)與NG組比較，P<0.05；(2)與HG組比較，P<0.05。

3 討論

近年的研究發(fā)現(xiàn)，HGF具有延緩DN病變的作用，HGF對腎組織多種細(xì)胞表現(xiàn)出保護(hù)作用[4]。HGF受體在腎臟表達(dá)相當(dāng)廣泛，是c-met原癌基因編碼的一種跨膜酪氨酸激酶[5]。HGF作為一種多效性的生長因子，與受體結(jié)合引起酪氨酸激酶活化，激活細(xì)胞內(nèi)多個信號級聯(lián)反應(yīng)[7-9]。在體和離體的高糖誘導(dǎo)腎系膜細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激，及TGF-β1介導(dǎo)的Fn、Col-3的合成，均可被外源性HGF抑制[10-12]； HGF具有抑制腎小管上皮細(xì)胞在腎臟疾病中發(fā)生的炎癥、纖維化病變及間質(zhì)損傷的作用[12-15]，增加HGF可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡[16]；研究發(fā)現(xiàn)，給予血管緊張素-2誘導(dǎo)腎臟病變的HGF轉(zhuǎn)基因小鼠在纖維化進(jìn)程中仍表現(xiàn)出介導(dǎo)腎組織肌成纖維細(xì)胞凋亡的作用，發(fā)揮抗纖維化特性[17]。HGF阻斷或抑制腎臟的纖維化病變，主要是由于HGF與TGF-β1信號通路之間的“crosstalk”架聯(lián)[18]。TGF-β1與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后，磷酸化胞內(nèi)Smad2/3蛋白與Smad4結(jié)合并核移位，將細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核，誘導(dǎo)目的基因的活化和轉(zhuǎn)錄[1,19]。系膜細(xì)胞HGF不影響TGF-β1介導(dǎo)Smad2蛋白的磷酸化，但是能快速地上調(diào)Smad轉(zhuǎn)錄共抑制因子(TG-interacting factor，TGIF)，增多的TGIF顯著抑制依賴TGF-β1/Smad信號通路的靶基因啟動子的活化，并且完全抑制了TGF-β1介導(dǎo)的α-SMA表達(dá)[6]。在人腎小管上皮細(xì)胞和腎臟纖維化梗阻性腎病動物實驗，HGF不影響TGF-β1誘導(dǎo)的Smad2的磷酸化和核轉(zhuǎn)位，而是誘導(dǎo)Smad轉(zhuǎn)錄抑制物SnoN蛋白的表達(dá)，如果阻斷細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase-1 and -2，ERK1/2)ERK1/2信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，HGF上調(diào)SnoN表達(dá)的效應(yīng)將被中斷[5-6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與NG組相較，HG組NRK-52E細(xì)胞中α-SMA和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；與高糖組比較，10 μg/L或20 μg/L rhHGF與高糖聯(lián)合處理均可介導(dǎo)E-cadherin表達(dá)上調(diào)，α-SMA表達(dá)下調(diào)，Col-Ⅲ合成減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HGF抑制腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程及Col-Ⅲ合成增多，具有對抗致纖維化效應(yīng)。與正常糖環(huán)境相比，高糖可以激活腎小管上皮細(xì)胞 ERK1/2信號通路，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；加入10 μg/L或20 μg/L rhHGF后該通路進(jìn)一步活化加強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HGF可激活胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究進(jìn)一步檢測了SnoN蛋白和mRNA的表達(dá)，高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞中SnoN蛋白的表達(dá)減少，但mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；予以10 μg/L或20 μg/L rhHGF干預(yù)后，與單純高糖條件刺激，腎小管上皮細(xì)胞SnoN蛋白表達(dá)增多，mRNA表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示在高糖狀態(tài)下，加入外源性HGF可以通過活化ERK1/2信號通路進(jìn)一步上調(diào)SnoN在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，進(jìn)而增加其蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)出負(fù)反饋抑制調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads通路的效應(yīng)。這與Tan等[6]的研究結(jié)果相似。但本課題組前期體內(nèi)和體外研究表明，高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞HGF蛋白和mRNA都呈現(xiàn)出先增多后減少的趨勢，活化的ERK1/2隨高糖刺激時間的延長呈現(xiàn)出持續(xù)高表達(dá)的現(xiàn)象[20]。ERK1/2在腎纖維化發(fā)病過程中，既可被HGF激活也可被其他細(xì)胞因子激活參與腎小管上皮細(xì)胞EMT過程[21-25]。因此，在DN發(fā)病過程中活化的ERK1/2是被HGF激活還是TGF-β1激活，以及是發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)還是促纖維化效應(yīng)都有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，HGF在DN過程中能阻斷或?qū)垢咛墙閷?dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程和間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并且HGF抗纖維化效應(yīng)是通過活化上調(diào)SnoNmRNA表達(dá)，抑制TGF-β1/Smads信號通路起作用。