楊挺， 俞慧， 黃偉

(江南大學(xué)附屬醫(yī)院 & 無(wú)錫市第三人民醫(yī)院 急診科， 江蘇 無(wú)錫 214000)

膿毒癥是機(jī)體對(duì)細(xì)菌感染作出過(guò)度反應(yīng)的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，如不及時(shí)處理則進(jìn)展為嚴(yán)重膿毒癥，出現(xiàn)膿毒癥休克、多器官功能衰竭，若合并急性腎損傷(AKI)時(shí)，死亡率可達(dá)70%[1]。膿毒癥AKI的發(fā)病機(jī)制目前仍未闡明，對(duì)AKI的研究早期主要集中于血流動(dòng)力學(xué)或(和)炎癥因子方面，近幾年的研究證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒癥過(guò)程中起著重要的作用。核因子相關(guān)因子(Nrf2)是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，Nrf2/ARE通路是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[2-3]。本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備大鼠膿毒癥AKI模型，并應(yīng)用姜黃素進(jìn)行干預(yù)治療，于造模后6、12、24及48 h時(shí)，檢測(cè)大鼠腎組織中Nrf2蛋白及血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平，探討姜黃素在膿毒癥AKI中的作用及機(jī)制，為膿毒癥AKI的臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑 清潔級(jí)雄性SD大鼠96只，體質(zhì)量(260±20)g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；AU400全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本olympus公司，尿素氮(BUN)及肌酐(Scr)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 96只大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、治療組。模型組和治療組大鼠參考文獻(xiàn)[4-5]采用CLP法制備膿毒癥AKI大鼠模型，造模前大鼠禁食12 h、禁水6 h，以3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定大鼠于操作臺(tái)，剪去腹部體毛、消毒后沿腹正中線皮膚開(kāi)約2 cm切口，暴露腹腔臟器；找到盲腸游離盲端，取出盲腸，在距盲端1 cm處結(jié)扎，用18號(hào)針頭在近端及末端貫通穿刺2次，施壓于盲腸擠出少量腸內(nèi)分泌物于腹腔內(nèi)，放置1根直徑約0.5 cm的硬質(zhì)導(dǎo)管并固定，回納盲腸，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后即刻在股部皮下注射生理鹽水進(jìn)行抗休克處理，液體量為4 mL/100 g，回籠。對(duì)照組采用同樣方法開(kāi)、關(guān)腹，但盲腸不結(jié)扎穿孔，也不留置導(dǎo)管。治療組于造模1 h后按100 mg/kg劑量給予姜黃素注射入腹腔，模型組及對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水。

1.2.2血清BUN、Scr水平及腎臟組織勻漿Nrf2蛋白水平 分別于造模后6、12、24及48 h麻醉大鼠，每組8只，麻醉后于大鼠左側(cè)第3、4肋間心尖搏動(dòng)最強(qiáng)處針尖刺入采血，離心分離血清，采用日本Olympus AU400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清BUN及Scr水平；開(kāi)腹分離腎臟組織，腎臟組織置-80 ℃冰箱凍存、采用 Western blot法檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)水平，用凝膠圖像處理系統(tǒng)將結(jié)果掃描成電子圖像，以條帶分析軟件Quantity One 4.4.0分析，計(jì)算出光密度值(OD值)，用目標(biāo)帶與內(nèi)參照β-actin的光密度比值來(lái)衡量表達(dá)情況，作為Nrf2的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3腎臟組織學(xué) 另取造模后12 h的腎臟組織用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色，于光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織學(xué)變化，以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性評(píng)估AKI損傷程度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清BUN及Scr水平

造模后6、12、24及48 h時(shí)，與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著降低(P<0.01)；與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，治療組大鼠血清BUN及Scr水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示造模1 h后給予姜黃素注射能改善膿毒癥大鼠腎功能。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時(shí)的血清BUN及Scr水平

注：(1)與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01；(2)與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01；(3)與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01。

2.2 腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白(OD值)

造模后6、12、24及48 h時(shí)，與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，模型組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，治療組大鼠腎臟組織勻漿中Nrf2蛋白OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 腎臟組織學(xué)

HE染色結(jié)果可見(jiàn)，造模后12 h 時(shí)，對(duì)照組各時(shí)間段腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明 顯 病 理 變 化(圖1A)。模型組大鼠部分腎小球周?chē)g質(zhì)充血，可見(jiàn)腎小管水腫，腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1 B)，而治療組小鼠腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況較同時(shí)點(diǎn)模型組減輕(圖1C)。

表2 3組大鼠造模后6、12、24及48 h時(shí)的腎臟勻漿組織中Nrf2蛋白水平比較

注：(1)與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01；(2)與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01；(3)與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，P<0.01。

注：A為對(duì)照組，B為手術(shù)組， C為治療組。

3 討論

膿毒癥是由感染引起的嚴(yán)重的SIRS，其病理生理機(jī)制復(fù)雜且易受多種因素影響，目前缺乏有效的防治方法。膿毒癥在后期常發(fā)生多器官功能衰竭，肺臟、肝臟、胃腸道、腎臟以及血液系統(tǒng)常最先受累，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在被診斷為膿毒癥的患者中約有42%伴有不同程度的AKI，此類(lèi)患者的死亡率高達(dá)74.5%，且有逐年上升的趨勢(shì)[6]。近幾年國(guó)外的很多研究均證明AKI時(shí)伴有氧化應(yīng)激的發(fā)生。Nrf2是近幾年來(lái)研究較多的細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)協(xié)調(diào)誘導(dǎo)對(duì)抗氧化應(yīng)激蛋白和Ⅱ相解毒酶的的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在機(jī)體防御外來(lái)侵襲、抵御毒性損害中起關(guān)鍵作用[7-8]。Nrf2含有6個(gè)不同的功能區(qū)，被命名為Neh1-Neh6[9-10]。目前的研究證明Nrf2主要在代謝和解毒的組織中表達(dá)，比如腎臟、肝臟，還有一些持續(xù)與外界壞境接觸的組織如皮膚、肺和消化道等[11-12]。生理狀態(tài)下，Nrf2與細(xì)胞質(zhì)中的果蠅肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Kelch結(jié)合，抑制Nrf2的表達(dá)，使其無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)[13]。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后或在蛋白激酶C的作用下，Nrf-2與Keap1解耦聯(lián)，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，進(jìn)而與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，在對(duì)照組大鼠腎臟組織中檢測(cè)出Nrf2，表明正常腎臟組織中存在Nrf2，模型組Nrf2水平較對(duì)照組明顯下降，其蛋白相對(duì)量先逐漸上升后期出現(xiàn)下降，提示膿毒癥損傷后強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷了機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng)，致使Nrf2水平的下調(diào)；同時(shí)膿毒癥產(chǎn)生的大量毒素作用于炎癥細(xì)胞，其產(chǎn)生的多種炎癥介質(zhì)在早期促使Nrf2入核反應(yīng)增加，Nrf2在腎臟組織中表達(dá)上調(diào)，內(nèi)源性抗損傷能力增強(qiáng)。隨著膿毒癥損傷加重，大量蓄積的ROS導(dǎo)致氧化-還原失衡，組織、細(xì)胞損傷加重，Nrf2出核減少，機(jī)體抗氧化能力減弱，最終出現(xiàn)嚴(yán)重的器官功能損害。由此可見(jiàn)，Nrf2在膿毒癥抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮了重要作用，為臨床治療膿毒癥提供了新的思路，但其深入的作用機(jī)制，仍待進(jìn)一步研究。

姜黃素(curcumin)最初是在1870年從姜黃中分離出來(lái)的一種相對(duì)分子質(zhì)量小的多酚類(lèi)化合物，普遍認(rèn)為它是姜黃中最有效的成分，有著較為廣泛的藥理作用，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗炎癥損傷、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用。姜黃素含有多個(gè)功能基團(tuán)，包含2個(gè)酚羥基、2個(gè)不飽和酮雙鍵、1個(gè)中性活性亞甲基及1個(gè)β-二酮基，酚羥基和β-二酮是抗氧化活性部分。姜黃素中含有2個(gè)α、β不飽和羰基序列可能是激活Nrf2的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，有學(xué)者通過(guò)加氫還原該結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)可降低Nrf2的活化，同樣具有αβ不飽和羰基的15d-PGJ2與Dimethoxycurcumin也能激活Nrf2。本研究結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)后的膿毒癥大鼠，Nrf2水平較手術(shù)組明顯升高，腎小球及腎小管充血水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕，提示姜黃素可能通過(guò)Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮氧化應(yīng)激作用，對(duì)腎臟起到保護(hù)的作用。研究報(bào)道，姜黃素可激活Nrf2核轉(zhuǎn)位，上調(diào)Nrf2水平，增加具有抗氧化作用的代謝酶合成，減輕細(xì)胞活性氧族/活性氮族水平，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能。姜黃素還可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，維持和/或增強(qiáng)各種抗氧化酶的活力，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GPx)等。楊開(kāi)艷等[14]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能提高脂多糖激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中SOD和GPx的活性，有效的清除氧自由基；有學(xué)者在對(duì)大鼠腎組織氧化應(yīng)激損害的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅可以降低大鼠血漿和腎組織中丙二醛(MDA)的含量，還可以提高GSH含量和GPx的活力，改善腎組織的氧化應(yīng)激損傷[15-17]。姜黃素在發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的同時(shí)，也表現(xiàn)一定程度的促氧化作用。姜黃素這一作用主要是通過(guò)過(guò)氧化物酶系統(tǒng)產(chǎn)生苯氧基團(tuán)，后者協(xié)同氧化細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽或NADH，在細(xì)胞攝入O2時(shí)產(chǎn)生ROS[18-20]。Sandur等[21]證實(shí)姜黃素的這種雙向作用與其在體內(nèi)的藥物濃度有關(guān)，兩者之間可以相互轉(zhuǎn)化；Hatcher等[22]也證實(shí)了同樣的看法，并進(jìn)一步指出姜黃素是一個(gè)自由基清除劑和氫供體，具有雙重活性。

綜上，姜黃素具有多種藥理作用，但具體機(jī)制至今尚未完全闡明，本研究從Nrf2的氧化應(yīng)激作用研究了姜黃素對(duì)于膿毒癥所致腎臟損傷的保護(hù)作用，對(duì)膿毒癥在基因?qū)寡趸较虻难芯刻峁┬碌乃悸?。?dāng)然膿毒癥作為一個(gè)涉及多因素的復(fù)雜病理、生理過(guò)程，仍需全面、系統(tǒng)、多層次的研究，才能攻克這一難題。