馮雨晴， 李 奚

(長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130012)

1 引 言

癌癥的早期診斷可以增加癌癥的治愈率并提高癌癥患者的生存率。因此，開(kāi)發(fā)具有高靈敏度的特異性癌癥精確診斷工具非常重要[1]。拉曼光譜(Raman)是一種研究生物分子的重要分析方法，但存在信號(hào)微弱的缺點(diǎn)[2]。隨著激光及納米技術(shù)的進(jìn)步，利用納米金屬材料(如金、銀)的表面等離子體共振效應(yīng)(Surface plasmon resonance，SPR)發(fā)展起來(lái)的表面增強(qiáng)拉曼散射光譜(Surface-enhanced Raman scattering，SERS)可使納米材料表面分子的拉曼信號(hào)強(qiáng)度增大103～106倍[3]，從而使其成為一種檢測(cè)痕量生物分子的重要工具，并應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物的鑒定[4-6]。其中，具有優(yōu)良生物相容性的金納米棒(Gold nanorods, AuNRs)由于制備簡(jiǎn)易、穩(wěn)定性高、消光系數(shù)大且縱向 SPR吸收峰(LSPR)從可見(jiàn)區(qū)到近紅外區(qū)連續(xù)可調(diào)[7]，從而表現(xiàn)出較好的光學(xué)性能而在體外SERS癌癥診斷應(yīng)用中受到廣泛關(guān)注[7-8]。

表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種由EGFR基因編碼的蛋白[9]。在EGFR基因發(fā)生突變后會(huì)引起EGFR蛋白過(guò)量表達(dá)，在細(xì)胞膜表面組裝，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面表皮生長(zhǎng)因子受體過(guò)多，可結(jié)合大量表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)，加速促進(jìn)細(xì)胞異常生長(zhǎng)和分裂，最終導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生[10-11]。因此，EGFR蛋白可作為腫瘤標(biāo)志物用于癌癥早期診斷。本文針對(duì)SERS光譜的激發(fā)波長(zhǎng)在785 nm，設(shè)計(jì)合成了LSPR吸收峰在785 nm的AuNRs以最大程度提高對(duì)吸收光的利用效率，并在AuNRs表面修飾了能夠特異性結(jié)合EGFR的抗體Anti-EGFR，利用經(jīng)典SERS探針?lè)肿?-MBA信號(hào)的變化，用于檢測(cè)細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)志物EGFR。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

人宮頸癌Hela細(xì)胞株、人腎上皮HEK-293細(xì)胞株購(gòu)置于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)、MTT檢測(cè)試劑盒為T(mén)hermo公司產(chǎn)品。對(duì)羥基苯甲酸(4-MBA)、聚乙二醇(m-PEG)購(gòu)自Sigma公司。人表皮生長(zhǎng)因子抗體(EGFR)為生工產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、爬片、96孔板、6孔板為NEST公司產(chǎn)品。

透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 F20 日本電子)，加速電壓30 kV；共聚焦拉曼光譜儀(alpha300R，美國(guó)WITEC),用785 nm的半導(dǎo)體激光器作光源，超快速拉曼光譜成像，光譜范圍400～4 000 cm-1，掃描時(shí)間15 s。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIOTEK ELx800)；臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)，THERMO FISHER)；激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)，Leica)。

2.2 金納米探針的合成

金納米棒(AuNRs)的合成采用文獻(xiàn)報(bào)道的晶體生長(zhǎng)法[12]。首先合成種子溶液：向5 mL、0.2 mol·L-1CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)溶液中加入5 mL、0.5 mmol·L-1氯金酸；再加入0.6 mL、0.01 mol·L-1新鮮配置的冰的硼氫化鈉，而后放入30 ℃水浴中靜置老化2 h后備用。金納米棒的生長(zhǎng)：將0.060 8 g CTAB加入到33 mL水中，加熱溶解，加入10 μL 0.01 mol·L-1硝酸銀，然后加入22.5 mmol·L-1氯金酸溶液297 μL，加入0.24 mL 0.1 mol·L-1的AA還原，溶液由黃色變透明，期間不斷攪拌；最后加入20 μL上述種子溶液后快速攪拌2 min后靜置過(guò)夜，讓金種生長(zhǎng)為金棒。離心(10 000 r/min，12 min)洗滌兩次，將純化后的金納米棒分散在超純水中備用。向合成的2 mL金納米棒溶膠中加入8.5 μL 10 μmol·L-1的4-MBA(4-巰基苯甲酸)，反應(yīng)過(guò)夜；14 000 r/min離心15 min，小心去除上層溶液，重分散在滅菌水中。按照上述步驟重復(fù)清洗2～3遍，再加入20 μL 20 mmol·L-1mPEG-SH過(guò)夜反應(yīng)，重復(fù)上述清洗步驟除去多余未反應(yīng)的PEG；之后再加入EGFR(pH=7.2的PBS緩沖溶液)，過(guò)夜反應(yīng)。重復(fù)上述清洗步驟，重分散在2.0 mL滅菌水中備用。

2.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

進(jìn)行AuNRs與靶向修飾的AuNRs粒子的細(xì)胞MTS毒性檢測(cè)，96孔板檢測(cè)，平行實(shí)驗(yàn)6組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293(人腎上皮細(xì)胞)細(xì)胞進(jìn)行鋪板，單孔細(xì)胞容量104，過(guò)夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，于對(duì)照組中加入培養(yǎng)液、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的兩種AuNRs繼續(xù)孵育培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞與兩種納米粒子共孵育24 h后加入MTS試劑(每孔10 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率并繪制圖表。將靶向修飾的金納米棒與Hela細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞)共孵育24 h后進(jìn)行暗場(chǎng)成像，對(duì)照組采用HEK-293細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞)。

2.4 SERS檢測(cè)

拉曼檢測(cè)如下：儀器用硅片校準(zhǔn)，拉曼峰位于520 cm-1，光譜范圍600～1 800 cm-1，樣品激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，激光實(shí)際功率5 mW，積累時(shí)間10 s。對(duì)于細(xì)胞SERS檢測(cè)，將粒子與細(xì)胞共孵育24 h后，選擇激發(fā)波長(zhǎng)785 nm，激光實(shí)際功率5 mW，累計(jì)時(shí)間10 s，光譜范圍600～1 800 cm-1，測(cè)20個(gè)細(xì)胞得到平均SERS光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米棒探針的表征

Anti-EGFR功能化金納米棒AuNRs probes可通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行形貌表征，如圖1所示。AuNRs probes形態(tài)均一，平均粒徑約為(42±11) nm(共統(tǒng)計(jì)328個(gè)金納米棒粒子)，長(zhǎng)徑比約為3.8。將金納米棒近似看作一個(gè)圓柱體，通過(guò)電感耦合等離子體發(fā)射光譜測(cè)定(Inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES)，可計(jì)算出AuNRs probes粒子濃度為1.31×1012/mL[13]，用于定量功能化修飾。

圖1 Anti-EGFR功能化的金納米棒AuNRs probes透射電鏡圖

Fig.1 TEM image of AuNRs probes

圖2分別為金納米棒AuNRs、AuNRs-MBA和AuNRs probes的可見(jiàn)吸收光譜(圖2(a))和SERS譜(圖2(b))。由圖可見(jiàn)，在785 nm處AuNRs有明顯LSPR吸收峰，當(dāng)AuNRs表面修飾拉曼染料4-MBA后，LSPR峰紅移15 nm至790 nm，且在SERS譜圖上1 100 cm-1與1 600 cm-1左右出現(xiàn)了特征峰，分別對(duì)應(yīng)于4-MBA分子的苯環(huán)呼吸特征振動(dòng)和軸向變形振動(dòng)[14]。單個(gè)拉曼染料4-MBA分子所占面積約為0.20 nm2，可估算出加入4-MBA的量為0.042 μmol·L-1，使其只占據(jù)金納米棒表面約50%，可以用于進(jìn)一步修飾靶向性Anti-EGFR分子。當(dāng)Anti-EGFR分子連接到AuNRs-MBA后，其可見(jiàn)吸收光譜LSPR峰紅移30 nm至820 nm，證明Anti-EGFR分子已被成功地修飾到金納米棒表面，與此同時(shí)，金納米棒表面SERS信號(hào)分子4-MBA的特征峰的峰位及強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化，可用于下一步SERS檢測(cè)。

圖2 金納米棒的紫外吸收光譜(a)和SERS光譜(b)

3.2 金納米棒探針細(xì)胞毒性檢測(cè)及暗場(chǎng)成像

由于金納米材料的強(qiáng)散射特性，可以用暗場(chǎng)顯微鏡來(lái)研究納米金顆粒與細(xì)胞的相互作用。圖3(a)是anti-EGFR靶向修飾AuNRs probes與HEK-293細(xì)胞暗場(chǎng)成像顯微鏡圖片，由于HEK-293細(xì)胞表面呈EFGR陰性，AuNRs probe不能與HEK-293產(chǎn)生特異性結(jié)合，因此未見(jiàn)大量金納米棒聚集于HEK-293細(xì)胞處。圖3(b)是AuNRs probes與Hela細(xì)胞暗場(chǎng)成像，由于Hela癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)EGFR，可與AuNRs probes上修飾的Anti-EFGR產(chǎn)生特異性識(shí)別，從而從暗場(chǎng)成像下我們觀察到anti-EGFR功能化的AuNRs probes可與Hela細(xì)胞發(fā)生相互作用，聚集在細(xì)胞邊緣處。并且通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)可證實(shí)(圖3(c))，AuNRs probes生物兼容性較好，可用于進(jìn)一步體內(nèi)拉曼成像顯影檢測(cè)。

圖3 AuNRs納米棒與HEK-293細(xì)胞(a)、Hela細(xì)胞(b)作用的暗場(chǎng)成像及細(xì)胞毒性MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果(c)。

Fig.3 Dark field images of HEK-293 cell(a), Hela cell(b) incubated with AuNRs probes and cell viability detection by MTS assay(c).

3.3 金納米棒探針細(xì)胞SERS檢測(cè)

將AuNRs-MBA和AuNRs probes分別與HEK-293細(xì)胞(EGFR陰性)和Hela細(xì)胞(EGFR陽(yáng)性)共孵育24 h后進(jìn)行SERS檢測(cè)。如圖4所示，無(wú)論是AuNRs-MBA還是AuNRs probes，位于1 100 cm-1和1 600 cm-1處拉曼信號(hào)分子4-MBA的特征吸收峰依然存在，由此證明AuNRs probes結(jié)構(gòu)穩(wěn)定適合用于活體細(xì)胞SERS檢測(cè)。由于細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的EGFR可與AuNRs probes 表面的Anti-EGFR產(chǎn)生特異性結(jié)合，從而使AuNRs probes大量聚集在Hela細(xì)胞表面(如圖3(b))，與Hela細(xì)胞共孵育測(cè)得AuNRs probes上4-MBA分子的1 100 cm-1和1 600 cm-1處的信號(hào)相較于通過(guò)非特異性吸附于細(xì)胞的AuNRs-MBA分別增強(qiáng)2.2倍和2.4倍；與此同時(shí)，AuNRs-MBA和AuNRs probes 與HEK-293細(xì)胞共孵育后，SERS特征峰強(qiáng)度變化不大(1 100 cm-1和1 600 cm-1處的信號(hào)分別增強(qiáng)1.2倍和1.3倍)。因此可通過(guò)比較與AuNRs-MBA和AuNRs probes共孵育前后SERS信號(hào)的變化來(lái)診斷表面腫瘤標(biāo)記物EGFR陽(yáng)性的癌細(xì)胞。

圖4 細(xì)胞與AuNRs納米棒共孵育24 h后的SERS光譜。 (a)HEK-293細(xì)胞；(b)粒子與Hela細(xì)胞。

Fig.4 SERS spectra of cell. (a) HEK-293 cell. (b) Hela cell.

4 結(jié) 論

我們通過(guò)共價(jià)修飾合成了生物兼容性好、且在細(xì)胞環(huán)境具有穩(wěn)定SERS信號(hào)的EGFR細(xì)胞靶向的金納米探針AuNRs probes。通過(guò)該AuNRs probes表面修飾的Anti-EGFR與癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的EGFR特異性識(shí)別，可使AuNRs probes更為有效地結(jié)合于癌細(xì)胞表面，使該探針上拉曼活性分子4-MBA在1 000 cm-1和1 600 cm-1的拉曼信號(hào)得到增強(qiáng)，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，為臨床新型癌癥早期篩查方法的研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。