(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025)

草石蠶(StachyssiebordiiMiq.)屬唇形科水蘇屬植物[1]，是我國(guó)的特色蔬菜之一[2]，江蘇、重慶、甘肅、貴州等省區(qū)均有種植[3]。草石蠶為我國(guó)創(chuàng)匯蔬菜，含有豐富的水蘇糖[4]，并富含蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；經(jīng)鹽漬、醬制加工后風(fēng)味獨(dú)特，為佐餐之佳品[5]；在保健食品和藥用開發(fā)利用方面前景十分廣闊[6-7]。

草石蠶為無性繁殖[8]，在長(zhǎng)期的無性繁殖過程中，易感染多種病毒，造成種性退化。組織培養(yǎng)不僅可以解決以上問題，而且還可以提純復(fù)壯[9]。遵義務(wù)川草石蠶為貴州優(yōu)質(zhì)品種，但在長(zhǎng)期栽培中存在種性退化問題，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)夭菔Q產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。草石蠶組培快繁方面的研究較少，且研究不夠深入[10-12]。為系統(tǒng)研究其組培快繁技術(shù)，針對(duì)草石蠶愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化進(jìn)行了研究，旨在加快繁殖速度，提高繁殖率，為加速草石蠶優(yōu)良種質(zhì)繁育和推廣步伐奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步研究草石蠶脫毒苗的快繁有重要的理論和實(shí)踐意義。

表1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

序號(hào)NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈傷誘導(dǎo)率/ % 鮮重/g 干重/g 愈傷顏色、質(zhì)地長(zhǎng)勢(shì)10.00.00.00.00Ef0.000Jj0.0000Fg無無20.02.00.516.25De0.049GHIefg0.0175BCDcd淺綠色顆粒++30.04.01.510.00De0.051GHIfg0.0171BCDcd褐色質(zhì)密+40.06.02.515.00De0.063FGHIefg0.0072DEdef綠色質(zhì)密+50.20.00.51.25De0.021HIgi0.0020Ef褐色質(zhì)密+60.22.00.066.25BCbcd0.071EFGHdef0.0178BCDcd綠色顆粒++70.24.02.571.25BCcd0.104CDEcd0.0183ABCbc綠色顆粒++80.26.01.562.50Cd0.084EFGde0.0144CDEde褐色顆粒++90.40.01.50.75De0.046GHIgi0.0078DEef褐色質(zhì)密+100.42.02.583.75ABCabc0.086EFGcd0.0138CDEde淺綠色顆粒++110.44.00.091.25ABab0.139ABCb0.0208ABab淺綠色質(zhì)密++120.46.00.577.50BCbc0.159Aa0.0252Aab褐色顆粒+130.60.02.56.25De0.012Hi0.0064DEef褐色質(zhì)密+140.62.01.588.75ABabc0.125BCDbc0.0201ABab淺綠色質(zhì)密+150.64.00.588.75ABabc0.147ABb0.0267Aab綠色質(zhì)密++160.66.00.096.25Aa0.153Aa0.0270Aa淺綠色顆粒+++

注：表中同列不同大寫字母表示p<0.05；不同小寫字母表示p<0.01。下同。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣主栽草石蠶品種。

1.2 方 法

1.2.1愈傷組織誘導(dǎo)

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好幼嫩的草石蠶葉片和莖段，用75%乙醇浸泡2 s，再用1% NaClO溶液消毒10 min，用無菌水漂洗3～4次。將已滅菌的葉片(切成1 cm × 1 cm方塊)和莖段(約0.8 cm)接種到不含激素的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)4 d后接種到MS + NAA 0、0.2、0.4、0.6 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、0.5、1.5、2.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上，進(jìn)行三因素四水平 L16(43)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究培養(yǎng)基中6-BA、NAA和GA3對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。每個(gè)處理接種80個(gè)外植體，3次重復(fù)。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的條件下培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)狀況。

1.2.2不定芽誘導(dǎo)

稱取長(zhǎng)勢(shì)良好一致的0.3 g愈傷組織接種到MS+NAA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、1、2、3 mg·L-1的培養(yǎng)基上，進(jìn)行三因素四水平 L16(43)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究培養(yǎng)基中6-BA、NAA和GA3對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。每處理培養(yǎng)30個(gè)愈傷，3次重復(fù)。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的條件下培養(yǎng)40 d后，觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)調(diào)查統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織干鮮重、不定芽誘導(dǎo)率及芽長(zhǎng)等。

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=(形成的愈傷組織數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%。

不定芽誘導(dǎo)率(%)=(誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)/接種的愈傷組織數(shù))×100%。

采用DPS(7.05)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，LSD方法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.1.1草石蠶莖段愈傷組織的誘導(dǎo)

當(dāng)6-BA、NAA、GA3均為0時(shí)，未誘導(dǎo)出愈傷組織(表1)。當(dāng)6-BA濃度為0時(shí)，各處理的相關(guān)指標(biāo)與其他處理(6-BA濃度為2、4、6 mg·L-1)相比差別最大，說明6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大。處理16誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)率最大，為96.25%，處理11、14、15、10和處理12的愈傷組織誘導(dǎo)率分別為91.25%、88.75%、88.75%、83.75%和77.50%，處理16的愈傷組織誘導(dǎo)率與處理12達(dá)極顯著差異水平。由以上可知，處理16的莖段愈傷組織誘導(dǎo)效果最好；處理12的愈傷組織鮮重最大，為0.159 g；處理16次之，為0.153 g，但兩者之間未達(dá)到顯著性差異水平；處理15和處理11的愈傷組織鮮重分別為0.147 g和0.139 g，并與處理12之間達(dá)到顯著性差異水平。處理16的愈傷組織干重最大，為0.027 0 g；處理15、12和處理11的愈傷組織干重分別為0.026 7 g、0.025 2 g和0.020 8 g，它們與處理16之間均未達(dá)到顯著性差異。處理12的愈傷組織為褐色顆粒，而處理16的愈傷組織為淺綠色顆粒，并且處理16的愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)最好。綜合考慮，處理16(MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6.0 mg·L-1)為莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

序號(hào)NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈傷誘導(dǎo)率/%鮮重/g 干重/g 愈傷顏色、質(zhì)地長(zhǎng)勢(shì)10.000.00.00Fk0.000Ff0.000Fg無無20.020.575.00ABCabcd0.124DEde 0.025DEef淺綠色顆粒+++30.041.555.00BCDcdef0.173DEde0.037DEdef淺綠色顆粒++40.062.543.75CDEef0.077Ede 0.015DEef淺綠色顆粒++50.200.531.25DEfg0.044Ee0.012Eef 淺綠色顆粒++60.220.092.50Aab0.508ABab0.058CDEde褐色顆粒++70.242.551.25BCDdef0.145DEde0.025DEef 淺綠色顆粒+80.261.576.25ABab0.354BCDbc0.069BCDcd褐色顆粒+90.401.513.75Eg0.094DEde 0.003Ef 淺綠色顆粒+100.422.555.00BCDcdef0.246CDEcd0.052CDEde淺綠色顆粒++110.440.068.75ABCbcd0.523ABab0.109ABab褐色質(zhì)密+120.460.590.00Aab0.440ABCb0.093ABCcd淺綠色顆粒++130.602.513.75Eg0.021Ee0.004Ef 淺黃色顆粒+140.621.566.25ABCbcd0.210DEde0.068BCDcd黑色顆粒+150.640.591.25Aab0.498ABab0.109ABab淺綠色質(zhì)密+++160.660.097.50Aa0.647Aa0.132Aa淺綠色顆粒+++

2.1.2草石蠶葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

由表2可知，以葉片為外植體，當(dāng)6-BA、NAA、GA3均為0時(shí)，無愈傷組織被誘導(dǎo)出。當(dāng)6-BA濃度為0時(shí)，各處理的相關(guān)指標(biāo)與其他處理(6-BA濃度為2、4、6 mg·L-1)相比差別最大，說明6-BA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大。處理16的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)97.50%，除處理15、6、12、8和處理2外，與其它處理之間均達(dá)到了顯著性差異水平。處理16的鮮重和干重均最大，分別為0.647 g和0.132 g，處理11的鮮重和干重次之，處理16與處理11之間的鮮、干重差異不顯著。愈傷組織顏色、質(zhì)地較好的分別為處理2、3、4、5、7、9、10、12、16。愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)良好的是處理2、15、16。綜上所述，處理16為葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比組合。

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽分化的影響

不定芽分化是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟之一。當(dāng)6-BA濃度為0時(shí)，愈傷組織不能被誘導(dǎo)出芽，說明6-BA在不定芽誘導(dǎo)中起著決定性作用(表3)；隨著6-BA濃度的增高，不定芽誘導(dǎo)率升高。本試驗(yàn)不定芽誘導(dǎo)率最高的為處理4，誘導(dǎo)率達(dá)76.67%；其次為處理3，誘導(dǎo)率為53.33%，并與處理4之間達(dá)到極顯著差異水平。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，不定芽的誘導(dǎo)率呈降低趨勢(shì)；說明高濃度的6-BA和低濃度的NAA培養(yǎng)基配方有利于草石蠶不定芽的誘導(dǎo)，以處理4為最佳。

由表3可知，處理3分化不定芽數(shù)最多，為13.25個(gè)，其次為處理4，為11.91個(gè)，兩處理間未達(dá)到顯著性差異水平。不定芽長(zhǎng)勢(shì)最好的是處理2和處理4，其次是處理3。處理11的株高最大，為4.00 cm，但長(zhǎng)勢(shì)較弱，處理4的株高雖然不高，但長(zhǎng)勢(shì)最好，明顯優(yōu)于處理11。綜合考慮，處理4(MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1)為草石蠶不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

3 討 論

3.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

草石蠶愈傷組織的高效誘導(dǎo)是草石蠶組織培養(yǎng)過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，為基因工程等研究提供技術(shù)支撐，同時(shí)，也為提取、分離其中保健及藥理有效成分提供了材料。王莉以美國(guó)“草原”薄荷為材料，研究其愈傷組織中揮發(fā)油成份，認(rèn)為外源類激素物質(zhì)是愈傷組織誘導(dǎo)的重要因素[13]。張春梅等對(duì)銀斑百里香研究得出，MS + NAA 0.15 mg·L-1+ 6-BA 0.6 mg·L-1是最佳的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基[14]。蔡漢權(quán)研究認(rèn)為，羅勒的最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS + NAA 0.1 mg·L-1+ 6-BA 4.0 mg·L-1[15]。張東向等研究發(fā)現(xiàn)，黃芩的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + NAA0.2 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1[16]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，草石蠶莖段和葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6 mg·L-1。王貽蓮等研究得出，NAA是影響薄荷誘導(dǎo)愈傷的重要因素，在濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)92%以上[17]。許真研究認(rèn)為，BA 對(duì)藠頭愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用，濃度越高形成愈傷組織越多[18]。隨著6-BA濃度的增加，枸杞花藥愈傷組織誘導(dǎo)率越高，以MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1最佳[19]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，6-BA對(duì)草石蠶愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，當(dāng)濃度為0時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)較低，并且長(zhǎng)勢(shì)不好；當(dāng)6-BA濃度為6 mg·L-1時(shí)，其愈傷組織誘導(dǎo)率最高，長(zhǎng)勢(shì)也最佳。這與許真[18]和段麗君[19]的研究結(jié)果一致，但與王貽蓮等[17]的研究結(jié)果不同，這可能與試驗(yàn)材料不同有關(guān)。

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

處理NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)接種數(shù)/個(gè)誘導(dǎo)數(shù)/個(gè)誘導(dǎo)率/%芽數(shù)/個(gè)株高/cm長(zhǎng)勢(shì)10.1003000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 20.12130930.00Cc6.56Abc1.44BCb+++30.142301653.33Bb13.25Aa1.51Bb++40.163302376.67Aa11.91Aab0.60Cc+++50.3013000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 60.32030413.33CDcd8.75Aabc1.03BCb+70.34330826.67CDcd3.75Ac1.73Bb+80.362301240.00Cc4.50Ac1.48Bb+90.5023000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 100.52330516.67CDcd6.00Abc2.30Bb+110.5403013.33Dd3.00Ac4.00Aa+120.56130310.00CDcd7.00Abc2.10Bb+130.7033000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 140.7223026.67Dd5.50Ac1.50Bb+150.74130310.00CDcd4.50Ac0.95BCb+160.7603013.33Dd4.50Ac1.85Bb+

3.2 植物生長(zhǎng)調(diào)劑對(duì)不定芽的誘導(dǎo)的影響

愈傷組織誘導(dǎo)不定芽是脫分化細(xì)胞進(jìn)行再分化的過程，其成功的關(guān)鍵因素是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的濃度配比。不同激素種類在不同植物上使用時(shí)存在很大差異[20-22]。一般情況下，誘導(dǎo)不定芽時(shí)，細(xì)胞分裂素要比生長(zhǎng)素濃度高。中等濃度(1.0～2.0 mg·L-1)的細(xì)胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)與低濃度(0.1～1.0 mg·L-1)的NAA配合均能促使魔芋Ⅲ型(淺紅或綠色，呈瘤狀或球狀，結(jié)構(gòu)致密)愈傷組織再生植株[23]。陳丹萍等[12]以草石蠶莖尖、莖段組織為外植體直接誘導(dǎo)不定芽，得出MS+6-BA 7.0 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1為最佳培養(yǎng)基，莖尖和莖段的不定芽誘導(dǎo)率分別達(dá)39.2%和33.3%。本試驗(yàn)經(jīng)愈傷組織間接再生途徑誘導(dǎo)不定芽時(shí)，得出MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1培養(yǎng)基的效果最佳，不定芽誘導(dǎo)率為76.67%，大大提高了不定芽誘導(dǎo)率。

在辣椒材料上，誘導(dǎo)不定芽的6-BA最佳濃度為 5 mg·L-1，濃度太低，不定芽誘導(dǎo)率不高，而濃度大于 6 mg·L-1時(shí)，雖然不定芽能被大量誘導(dǎo)，但質(zhì)量差，大部分為畸形，繼續(xù)培養(yǎng)芽難以伸長(zhǎng)[24-26]。張煒坤等研究認(rèn)為，隨6-BA濃度升高(1～3 mg·L-1)，北蒼術(shù)不定芽誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢(shì)，但6-BA濃度不能過高，當(dāng)達(dá)到3 mg·L-1時(shí)，不定芽的葉片卷曲，幼苗出現(xiàn)玻璃化和畸形現(xiàn)象[27]。本研究得出，草石蠶不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1，不定芽誘導(dǎo)率為76.67%，并且芽長(zhǎng)勢(shì)最好，這與前人研究的結(jié)果不一致，這主要是因?yàn)椴煌囼?yàn)材料對(duì)6-BA的忍耐程度有關(guān)。林碧英等對(duì)生姜的研究表明，在NAA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，生姜生長(zhǎng)點(diǎn)成芽率下降[28]。但本研究認(rèn)為，NAA濃度低時(shí)(0.1 mg·L-1和0.3 mg·L-1)，隨著6-BA濃度的增加，草石蠶不定芽誘導(dǎo)率逐漸增加，這與林碧英等研究的結(jié)果相反，這主要是與試驗(yàn)材料和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度不同有關(guān)。