唐陽(yáng)，周頁(yè)，吳珊，王潔雪

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院功能分子研究所，四川成都 611130）

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖[1]，分布在我國(guó)的廣東、貴州、福建、海南、云南、廣西和四川等地，別稱蜜姜、南姜、小良姜、良姜等。高良姜性熱味辛，具有消食、止痛、溫中散寒之功效[2]，是治療冷腸泄瀉、反胃吐食、胃寒少食等癥狀的良好藥材[3]。高良姜含有多種化學(xué)成分，其中黃酮類成分高良姜素（Galangin，3,5,7-三羥基黃酮）是高良姜藥材的主要藥效成分，同時(shí)也是該藥材的質(zhì)量控制成分[4-6]。由于高良姜素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，且毒性較低，是一種具有良好開(kāi)發(fā)前景的天然化學(xué)預(yù)防藥物，已成為國(guó)內(nèi)醫(yī)藥界研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[7]。

本文以高良姜素為對(duì)照品，采用高效液相色譜法[8-9]，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化高良姜中高良姜素的最佳提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高良姜藥材提供有用的數(shù)據(jù)和可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀、AUW120D電子分析天平、ULTRASONIC CLEANER超聲儀、NAIZFCDY-6索氏提取器、HU-ZK4電熱恒溫水浴鍋。

高良姜藥材，購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng)；高良姜素對(duì)照品（HPLC=98.31%，成都康邦生物科技有限公司生產(chǎn)），乙腈為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU shim-pack GISS C18（4.6×250 mm 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 高良姜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取高良姜素對(duì)照品10.34 mg，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，制得1.034 mg/mL高良姜素對(duì)照品貯備液。分別取高良姜素對(duì)照溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL和14 μL進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣體積（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到高良姜素的回歸方程為Y=4 590 999X+8 770 984，R2=0.999 7。表明高良姜素在4.136～14.476 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.4 樣品溶液的制備

精密稱取高良姜藥材1.0 g，干燥后粉碎過(guò)40目篩，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，在相應(yīng)溫度下超聲提取規(guī)定時(shí)間，離心，定容至10 mL，得樣品溶液。高良姜提取液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液10 μL進(jìn)行高效液相色譜分析，并根據(jù)峰面積計(jì)算高良姜素得率。計(jì)算公式：高良姜素得率（mg/g）=提取得到的高良姜素質(zhì)量（mg）/高良姜藥材質(zhì)量（g）。

以高良姜素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察不同提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度對(duì)高良姜中高良姜素含量的影響。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定因素水平范圍，利用Design Expert Software 軟件輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)高良姜素得率的影響

固定料液比1∶8，乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，超聲提取2次，考察不同超聲提取時(shí)間對(duì)高良姜素提取率的影響。結(jié)果如圖1顯示，從10～30 min提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在25 min時(shí)達(dá)最大值0.90，再延長(zhǎng)超聲時(shí)間，提取率趨于平穩(wěn)，略有下降。因此，選擇超聲時(shí)間在25 min左右適宜。

2.1.2 提取次數(shù)對(duì)高良姜素得率的影響

固定料液比1∶8，乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，提取25 min，考察不同提取次數(shù)對(duì)高良姜素提取率的影響。圖2結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)增加，提取率升高，在3次后提取率增加不明顯，增幅為2%。綜合實(shí)驗(yàn)工作量及提取率，選擇提取次數(shù)在2次左右適宜。

2.1.3 料液比對(duì)高良姜素得率的影響

固定乙醇濃度為90%，超聲溫度50 ℃，提取25 min，提取2次，按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12加入提取溶劑，考察不同料液比對(duì)高良姜素提取率的影響。圖3結(jié)果表明，1∶8的料液比達(dá)到最大的提取率0.97，再增大料液比，高良姜素得率反而下降，可能的原因隨著料液比的增大，其他物質(zhì)的溶出增加。因此，料液比為1∶8左右為宜。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)高良姜素得率的影響

固定料液比為1∶8，超聲溫度50 ℃，提取25 min，提取2次，考察不同乙醇濃度對(duì)高良姜素提取率的影響。圖4結(jié)果表明，80%～100%乙醇濃度范圍內(nèi)，高良姜素提取率隨乙醇濃度增加而升高，原因可能是高良姜素化合物極性較低的原因。因此，選擇提取乙醇為無(wú)水乙醇。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化高良姜素提取條件

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以對(duì)高良姜素得率影響最大的幾個(gè)因素為自變量，以高良姜素得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2

圖1 提取時(shí)間對(duì)高良姜素得率的影響

圖2 提取次數(shù)對(duì)高良姜素得率的影響

圖3 料液比對(duì)高良姜素得率的影響

圖4 乙醇濃度對(duì)高良姜素得率的影響

表1 響應(yīng)面的因素與水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

利用 Design -Expert 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)式回歸方程，高良姜素得率Y=+0.91+0.0025A-0.059B+0.056C-0.001AB+0.005AC-0.082BC-0.058A2-0.010B2+0.050C2，該多元回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，回歸項(xiàng)P=0.002 6＜0.01，回歸模型極顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。失擬項(xiàng)用來(lái)表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，即二者差異的程度。失擬項(xiàng)P=0.326 8＞0.05，影響不顯著，說(shuō)明模型擬合度很好。因此，能夠使用該回歸模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，優(yōu)化高良姜中高良姜素的提取工藝參數(shù)。各因素對(duì)高良姜素得率的影響次序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間。

為了觀察某個(gè)因素及其交互作用同時(shí)對(duì)高良姜素得率的影響，將其他因素保持條件不變，獲得每個(gè)因素及其交互作用對(duì)高良姜素得率影響的一組動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲面圖（圖5～7），從而確定因素的最佳參數(shù)范圍。

圖5 提取時(shí)間與料液比交互作用對(duì)高良姜素得率的影響

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

圖6 提取時(shí)間與乙醇濃度交互作用對(duì)高良姜素得率的影響

圖7 料液比與乙醇濃度交互作用對(duì)高良姜素得率的影響

由圖5可以看出，固定料液比、增加提取時(shí)間有利于提高高良姜素得率，繼續(xù)增加提取時(shí)間，高良姜素得率反而下降。由圖6可以看出，固定提取時(shí)間，增大乙醇濃度有利于提高高良姜素得率。由圖7可以看出，料液比與乙醇濃度交互作用曲面最陡峭，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)高良姜素得率影響最為顯著。固定乙醇濃度，減小料液比有利于提高高良姜素得率。

2.3 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證

通過(guò)Design -Expert軟件方程求解，以高良姜素得率為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面分析得到最佳提取高良姜素的工藝為：料液比為1∶6的無(wú)水乙醇超聲提取2次，每次25 min，高良姜素得率為1.15%。為驗(yàn)證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。實(shí)際測(cè)得的高良姜素得率的平均值為1.13%。結(jié)果說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間有很好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC作為純化指標(biāo)檢測(cè)方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度對(duì)高良姜素得率的影響，進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面法分析各因素交互作用對(duì)高良姜素得率的影響，優(yōu)化得到提取高良姜素的最佳工藝，料液比為1∶6的無(wú)水乙醇超聲提取2次，每次25 min，高良姜素得率的平均值為1.13%。優(yōu)化的提取工藝操作簡(jiǎn)便，且設(shè)備要求不高，提取使用的溶劑對(duì)環(huán)境無(wú)污染，使用的乙醇可回收蒸餾后重復(fù)使用，故提取成本較低，在后續(xù)工作中，按照此提取工藝大量制備高良姜素，以此開(kāi)展相關(guān)的活性測(cè)試研究。