王文娟，劉志東，寧喜斌,3,4,5*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海，200090) 3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 4(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估試驗(yàn)室(上海)，上海，201306) 5(國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)，上海，201306)

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，在動物、植物和微生物中分布廣泛，是產(chǎn)量最大、用途最廣的酶制劑品種之一[1-3]。目前，淀粉酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、紡織業(yè)、造紙業(yè)、醫(yī)藥與臨床分析等行業(yè)[4-5]，還有一些潛在的應(yīng)用包括淀粉加工、廢水的處理、生物乙醇的生產(chǎn)、低聚糖混合物的制造等[6]。

然而，當(dāng)前國內(nèi)外用于工業(yè)生產(chǎn)的淀粉酶大多數(shù)是中溫淀粉酶或者高溫淀粉酶，其最適溫度為50 ℃左右。這些酶在溫度下降以后，酶活力急劇下降甚至喪失，導(dǎo)致無法在低溫下發(fā)揮作用。低溫淀粉酶的最適作用溫度低于30 ℃，與中、高溫淀粉酶相比，能在溫度很低的情況下保持很大的活性，很大程度地減少了發(fā)酵處理的時間，節(jié)約了能源。1970年以后，國內(nèi)、外掀起了對低溫淀粉酶的研究熱潮[7-8]。

低溫淀粉酶來源廣泛，在動物、植物、微生物中都有發(fā)現(xiàn)，主要來源還是低溫微生物。一般低溫微生物來源于自然界中的極端環(huán)境，如南北極、海底沉積物、冰川、海水、高山、深山洞等。低溫淀粉酶在國外研究較早，F(xiàn)ELLER等從南極篩選到一株產(chǎn)低溫淀粉酶的河豚毒素交替單胞菌(AlteromorlashaloplanetisA23)[9-11],并且在結(jié)構(gòu)和功能方面對AlteromonashaloplanetisA23分泌的低溫淀粉酶進(jìn)行了研究。在0～30 ℃,該菌的淀粉酶活力比來自恒溫動物的淀粉酶活力高7倍。20世紀(jì)90年代以后，歐美及日本等國家在分子適冷機(jī)制、酶分子定向進(jìn)化、氨基酸序列分析、淀粉酶基因工程菌開發(fā)以及應(yīng)用等方面開展了大量工作。目前已經(jīng)研究了多種耐冷淀粉酶[12-13]，耐冷菌產(chǎn)生的適冷淀粉酶研究最多。國內(nèi)目前對低溫淀粉酶的報(bào)道不多，用于工業(yè)生產(chǎn)的更是屈指可數(shù)。周新尚等[14]從大連海泥和海水中篩選出一株產(chǎn)低溫淀粉酶的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，酶活較低，為6.25 U/mL。馮旭明等[15]從大黑山(大連)污泥中篩選出一株低溫淀粉酶高產(chǎn)菌株——微小桿菌屬(Exiguobacteriumsp.)，酶最適反應(yīng)溫度為25 ℃,酶的熱穩(wěn)定性比較差。國內(nèi)低溫淀粉酶的研究還比較淺顯，主要集中在菌株的篩選、鑒定、酶學(xué)性質(zhì)和基因等研究[15-17]，對其應(yīng)用和生產(chǎn)還需進(jìn)一步研究。南極處于地球的最南端，常年被冰雪覆蓋，溫度處于0 ℃以下，其海洋系統(tǒng)、陸地系統(tǒng)和冰雪環(huán)境是低溫微生物的重要寶庫。南極磷蝦作為開發(fā)南極海洋生物資源的最主要品種，其能適應(yīng)南極惡劣的極端環(huán)境并大量繁殖，這與其體內(nèi)微生物的低溫適應(yīng)性機(jī)制是分不開的，是低溫酶的極好材料。

本試驗(yàn)是從南極原位海水帶回的冷凍南極磷蝦蝦肉中篩選得到低溫淀粉酶的高產(chǎn)菌株，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。同時，通過在酶的反應(yīng)體系中添加一定量的Na+和Ca2+，初步提高了低溫淀粉酶的熱穩(wěn)定性，解決了低溫淀粉酶的熱穩(wěn)定性差這一問題，將為低溫淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

本試驗(yàn)所用的冷凍南極磷蝦由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所于2014年在南極打撈出并以原位海水冷凍后由雪龍?zhí)栠\(yùn)回，本實(shí)驗(yàn)室取回后置于-80 ℃保存，菌株由冷凍南極磷蝦蝦肉分離篩選并純化保存。

1.1.2 主要儀器

CX41RF顯微鏡，東京奧林匹斯公司；UV-1800PC紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HWS-24雙列四孔恒溫水浴鍋，上?；厶﹥x器制造有限公司；LRH-250CL低溫生化培養(yǎng)箱、THZ-300 恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司；超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司；PTC-200PCR儀、GelDocXR凝膠成像儀，Bio-Rad公司。

1.1.3 試劑

蛋白胨、酵母粉、可溶性淀粉、NaCl、CaCl2等均為國產(chǎn)分析試劑；革蘭氏染色液試劑盒、DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

初篩培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，NaCl 19.45，CaCl21.8，Na2S2O3·5H2O 3.24，瓊脂15，可溶性淀粉2，pH 7.0，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，NaCl 19.45，CaCl21.8，Na2S2O3·5H2O 3.24，可溶性淀粉2，pH 7.0，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，NaCl 19.45，CaCl21.8，Na2S2O3·5H2O 3.24，pH 7.0，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)淀粉酶菌株的初篩

將冷凍南極磷蝦用酒精棉擦拭表面后放于無菌取樣袋中，并置于超凈工作臺自然解凍。取解凍的南極磷蝦于無菌研缽中研磨均勻，并稱取2 g研碎的南極磷蝦樣品，加入20 mL已高壓蒸汽滅菌的無菌蒸餾水，然后劇烈振蕩10 min后取上清液于已滅菌的生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5梯度的稀釋液，每個梯度做3個平行，各取不同梯度的稀釋液100 μL于初篩平板培養(yǎng)基上均勻涂布，在低溫生化培養(yǎng)箱中于25 ℃倒置培養(yǎng)72 h噴灑碘液在平板上，觀察菌落周圍的透明圈大小。選取菌落周圍透明圈大的菌株進(jìn)一步四區(qū)劃線純化，并接種于斜面保藏。

1.2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌種接種到裝液量為100 mL/250 mL的復(fù)篩培養(yǎng)基中復(fù)篩，在恒溫?fù)u床中以25 ℃，120 r/min培養(yǎng)48 h后作為發(fā)酵液待測酶活。

酶活的測定：采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測酶活(以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線)

取發(fā)酵液1.5 mL在4 ℃，10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液做粗酶液待測酶活力。取1 mL稀釋酶液在25 ℃下水浴保溫5 min后滴加1 mL 20 g/L的淀粉溶液，將混合液在25 ℃下水浴保溫10 min，然后滴加2 mL DNS試劑，在沸水中保溫5 min，冷卻至室溫后定容至25 mL，置于540 nm處比色[18]。

(1)

式中：m，葡萄糖質(zhì)量，mg；n，酶液稀釋倍數(shù)；t，反應(yīng)時間，min。

酶活定義：在一定反應(yīng)條件下，1 min反應(yīng)生成1 mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活單位。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將產(chǎn)酶菌株在初篩培養(yǎng)基上進(jìn)行四區(qū)劃線分離純化，于低溫生化培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落做革蘭氏染色試驗(yàn)，并觀察其菌體形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[19,20]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，主要包括氧化酶試驗(yàn)、水解淀粉試驗(yàn)、反硝化、脂酶、膿青素、明膠液化、果糖、葡萄糖利用等。

1.2.3.3 16S rRNA基因序列測序和分析

將試驗(yàn)菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中于25 ℃下培養(yǎng)18 h，按照細(xì)菌總DNA提取試劑盒的說明書操作，提取細(xì)菌總DNA為模板DNA。擴(kuò)增16S rRNA基因所用的引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括：5 μL 2×TaqPCR Mix 2，20 μL Sterilized ddH2O，1 μL DNA模板，2 μL 10 μmol/L的上下游引物各。

PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃，變性1 min；57 ℃，退火1 min； 72 ℃，延伸10 min，按上述條件循環(huán)30次后4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察清晰明亮的條帶，剩余的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物技術(shù)工程有限公司基因測序，獲得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST基因序列比對。通過Mega 5.2用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[21]。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.4.1 菌株A5-2的生長曲線和產(chǎn)酶曲線的測定

取125 mL/250 mL菌液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 ℃，120 r/min條件下每隔6 h測定一次淀粉酶活性和OD600,每個樣品做3個平行，繪制菌株的生長曲線和產(chǎn)酶曲線。

1.2.4.2 反應(yīng)溫度對酶活的影響

分別測定粗酶液在4、15、20、25、30、40、50、60、70和80 ℃不同溫度下的酶活性，以確定其最適反應(yīng)溫度[8]。

1.2.4.3 反應(yīng)pH值對酶活的影響

分別測定粗酶液在pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的檸檬酸緩沖液中的酶活性，以確定其最適反應(yīng)pH[22]。

1.2.4.4 金屬離子對酶活力的影響

在酶的反應(yīng)體系中分別加入10 μL 0.01 mol/L的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Mn2+7種金屬離子,以不加金屬離子為對照組，測量各組的酶活力。

1.2.4.5 酶的熱穩(wěn)定性

將1 mL酶液分別在20、30、40、50、60和70 ℃，6個溫度條件下依次水浴保溫10、20、30、40、50 min，然后冷卻到室溫，定容到25 mL，測酶活。各保溫時間下所測得的酶活與不保溫所測得的酶活(記為100%)相比計(jì)算相對酶活，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線[23]。

1.2.4.6 Ca2+和Na2+對酶熱穩(wěn)定性的影響

在酶的反應(yīng)體系中分別加入10 μL 0.01 mol/L的Na+、Ca2+、10 μL 0.01 mol/L的Na+和Ca2+混合物(Na+、Ca2+各5 μL)，并以不加金屬離子為對照組，依次在50 ℃下水浴保溫，與不放在水浴中保溫的酶活相比，每10 min測一次相對酶活力[24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

通過初篩，共篩選出11株產(chǎn)淀粉酶菌株，再經(jīng)復(fù)篩選出1株淀粉酶高產(chǎn)菌株，編號為A5-2，酶活力值為163.73 U/mL。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果

菌株A5-2在2 216E瓊脂平板上25 ℃培養(yǎng)48 h后，菌落呈橙黃色，不透明，圓形隆起，邊緣整齊，無褶皺。革蘭氏染色為陰性，菌體呈球桿狀。

2.2.2 菌株生理生化鑒定

對菌株A5-2進(jìn)行生理生化特性研究，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株A5-2的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain A5-2

注：+為陽性，-為陰性

2.2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

菌株A5-2的16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，電泳條帶如圖1所示，1 500 bp處條帶清晰。

M-Marker(dl2000)，1-菌株A5-2圖1 菌株A5-2的PCR特異性條帶Fig.1 The electrophoresis map of PCR product of strain A5-2

菌株A5-2的16S rRNA基因序列拼接后提交GenBank數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST序列比對。通過Mega 5.2用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 A5-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the A5-2 on partial 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，A5-2與假單胞菌(Pseudomonassp.)的16S rRNA基因序列自然聚類。A5-2與乳酸假單胞菌PseudomonaslactisDSM 29167聚集在同一支，且同源性為100%，判定屬于同一種。根據(jù)A5-2的形態(tài)特征、生理生化鑒定結(jié)果，以及A5-2的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，將A5-2鑒定為乳酸假單胞菌(Pseudomonaslactis)，命名為PseudomonaslactisA5-2。該種是假單胞菌屬(Pseudomonassp.)中新發(fā)現(xiàn)的種，2 017年6月第1次由NEUBECK等[26]從牛原料乳中分離得到。

2.3 A5-2淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.483 6x+0.010 8，線性相關(guān)性R2=0.999 2，說明線性非常好。

2.3.2 A5-2的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

菌液在發(fā)酵培養(yǎng)基中于25 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每6 h測1次酶活和生物量，結(jié)果如圖3。

圖3 A5-2的生長曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.3 The growth curve and enzyme production curve of A5-2

由圖3的生物量曲線可知，菌株A5-2從培養(yǎng)6 h開始，菌體數(shù)量增長迅速，但24 h后增長緩慢并趨于穩(wěn)定，90 h后菌體開始走向衰亡。而產(chǎn)酶活性出現(xiàn)在菌株培養(yǎng)12 h后，產(chǎn)酶活性隨著菌株的快速增長而漸漸增強(qiáng)，菌株生長緩慢并趨于穩(wěn)定后，產(chǎn)酶活性也基本趨于穩(wěn)定并有緩慢增長，菌體開始衰亡以后，產(chǎn)酶活性也逐漸下降。菌株生長曲線的趨勢和產(chǎn)酶曲線的趨勢，大致保持相同，說明菌株所產(chǎn)的酶可能只存在于發(fā)酵上清液中，隨著菌體的自溶，并沒有其他酶產(chǎn)生[27]。相比ZHANG等[28]從南極分離的產(chǎn)低溫淀粉酶耐冷菌(Nocardiopsissp.)7 326在20 ℃下需培養(yǎng)120 h產(chǎn)酶才達(dá)到最高，該菌株產(chǎn)酶周期短，在工業(yè)應(yīng)用中具有很大的優(yōu)勢。

2.3.3 溫度對酶活的影響

按照上述試驗(yàn)方法，在不同的溫度中測淀粉酶的酶活，以酶活為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)，作溫度-酶活關(guān)系曲線圖，如圖4所示。

圖4 反應(yīng)溫度對酶活的影響Fig.4 Effect of operating temperature on enzyme activity

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在4～20 ℃范圍內(nèi)，酶活逐漸升高，且酶活都在最高酶活的75%以上。溫度高于20 ℃，酶活開始下降，尤其是50 ℃以后，酶活急劇下降，在80 ℃，酶活僅保留21%。所以，20 ℃是該淀粉酶的最適反應(yīng)溫度，菌株A5-2所產(chǎn)淀粉酶屬于典型的低溫淀粉酶，該酶的最適反應(yīng)溫度比WANG等[29]從南極海冰中篩選出的假交替單胞菌(Alteromonasbaumann)所產(chǎn)低溫淀粉酶的最適反應(yīng)溫度(30 ℃)更低，在工業(yè)應(yīng)用上可以節(jié)省很多能源，縮短發(fā)酵周期。

2.3.4 反應(yīng)pH值對酶活的影響

粗酶液在不同pH值的檸檬酸鹽緩沖液下，酶活力大小如圖7所示。

圖5 反應(yīng)pH對酶活的影響Fig.5 Effect of operating pH on enzyme activity

由圖5可以看出，當(dāng)pH在3.0～6.0時，隨著pH值的增大，淀粉酶活力隨之升高，當(dāng)pH大于6.0時，淀粉酶活力急劇下降，表明該淀粉酶的最適pH值為6.0，屬于弱酸性酶。

2.3.5 金屬離子對酶活力的影響

本試驗(yàn)以不加金屬離子的酶反應(yīng)體系作對照，測定不同的金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果如圖6所示。Fe3+、Cu2+和Mn2+對酶有不同程度的抑制作用，K+、Mg2+、Ca2+和Na+對酶有不同程度的激活作用，其中Cu2+對酶的抑制作用最強(qiáng)，抑制了80%的酶活性。Na+對酶的激活效果最強(qiáng)，酶活約為空白對照的1.7倍?？赡苁荂u2+、Fe3+和Mn2+等離子可以與蛋白的作用區(qū)域結(jié)合，從而抑制酶的活性。這與其他微生物來源的低溫淀粉酶特性一致[30]。

圖6 金屬離子對酶活的影響Fig.6 Effect of metal ions on enzyme activity

2.3.6 酶的熱穩(wěn)定性

以不保溫所測得的酶活為對照組，其他溫度下所測得的酶活與其相比計(jì)算得到相對酶活，用相對酶活繪出酶的熱穩(wěn)定性曲線，10 min測一次，共測50 min，計(jì)5次(圖7)。

圖7 酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of the enzyme

由圖7可知，該酶在20 ℃保溫50 min依然保持95%以上的酶活性，穩(wěn)定性極好，在30 ℃下保溫20 min，保留80%的酶活性，保溫50 min，保留了50%的酶活性。50 ℃保溫20 min，酶活喪失50%，60 ℃保溫20 min，酶活保留18%，70 ℃保溫10 min后酶活幾乎為0。范紅霞等[31]從南極土壤分離的南極微球菌(Micrococcusantarcticus)產(chǎn)的低溫淀粉酶在60 ℃溫浴20 min后酶活完全喪失。本試驗(yàn)所產(chǎn)的低溫淀粉酶的熱穩(wěn)定性相對較好，但也符合低溫酶穩(wěn)定性差的性質(zhì)，酶的熱穩(wěn)定性有待進(jìn)一步的提高。

2.3.7 Ca2+和Na2+對酶熱穩(wěn)定性的影響

本試驗(yàn)以未加金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對照組，測定在反應(yīng)體系中加入Na+、Ca2+以及Na+和Ca2+的混合物對酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 金屬離子對酶的熱穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the thermal stability of enzyme

由圖8與圖7對比可知，在酶液體系加入Na+以后，在50 ℃保溫35 min，酶活保留50%，相比于不加Na+的酶液體系保溫20 min，酶活保留50%，延長了15 min的半衰期，加入Ca2+以后，酶進(jìn)入半衰期的時間為40 min，同時加入Na+和Ca2+，酶的半衰期延長至80 min，是不加金屬離子的4倍，可能是加了Na+和Ca2+改變了酶的二級結(jié)構(gòu)，從而提高了酶的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從冷凍南極磷蝦蝦肉中篩選出1株產(chǎn)低溫淀粉酶的菌株，經(jīng)形態(tài)特征、生理生化和16S rRNA鑒定為乳酸假單胞菌，命名為PseudomonaslactisA5-2，該種是假單胞菌屬(Pseudomonassp.)中的新發(fā)現(xiàn)的種，2017年6月第1次由NEUBECK等[27]從牛原料乳中分離得到。

PseudomonaslactisA5-2產(chǎn)淀粉酶的酶活力為218.53 U/mL，該淀粉酶的酶學(xué)性質(zhì)表明，最適反應(yīng)溫度為20 ℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，屬于典型的弱酸性低溫淀粉酶。K+、Na+、Mg2+和Ca2+對酶有不同程度的激活作用，其中Na+對酶的激活效果最強(qiáng)，Cu2+、Fe3+和Mn2+對酶有不同程度的抑制作用。該酶在30 ℃以下能保持較長時間的穩(wěn)定，在50 ℃保溫20 min，酶活力僅保留50%，在酶的反應(yīng)體系中分別加入Na+、Ca2+和Na+、Ca2+混合物后，酶進(jìn)入半衰期的時間分別為保溫35、40和80 min，同時加入Na+和Ca2+后，酶的半衰期是不加金屬離子的4倍，可能是Na+和Ca2+改變了酶的二級結(jié)構(gòu)從而提高的酶的熱穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)研究的低溫淀粉酶能很好地適應(yīng)低溫和偏酸性的環(huán)境，并初步提高了酶的熱穩(wěn)定性，為以后該酶的分離純化以及工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供了依據(jù)[32-34]。