張啟偉, 鄭 琦

(江漢大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院, 交叉學(xué)科研究院, 光電化學(xué)材料與器件教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430056)

唾液酸(sialic acids)是神經(jīng)氨酸(neuraminic acid)的N-或O-取代衍生物,擁有相同的9碳核心結(jié)構(gòu),在自然界中已發(fā)現(xiàn)60余種[1,2]。神經(jīng)氨酸的N-或O-取代主要發(fā)生在C4、C5、C7、C8、C9位置,其中依據(jù)C5位置取代基團(tuán)的不同,唾液酸被分成3大類,即N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid, NeuAc)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid, NeuGc)和酮基-脫氧壬酮糖酸(2-keto-3-deoxynononic acid, KDN);發(fā)生在其他位置的取代基團(tuán)主要包括乙?；?、磺酸基、乳?；?、甲基和磷酸基等[3,4]。3種結(jié)構(gòu)最簡單的唾液酸如圖1所示,其他唾液酸均為此3種唾液酸的衍生物。

圖1 唾液酸的基本結(jié)構(gòu)

唾液酸大量存在于包括人體和各種脊椎動物體內(nèi),也存在于部分無脊椎動物、真菌和細(xì)菌中[3,5-9]。唾液酸有著廣泛的生物功能,可參與到細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞黏附與分化、神經(jīng)發(fā)育與記憶形成、腸道微生態(tài)平衡等生理過程;與此同時(shí),也與炎癥、癌癥、傳染病、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫疾病等病理性活動密切相關(guān)[10-14]。為了深入理解唾液酸的生物功能,糖組學(xué)領(lǐng)域的科研工作者經(jīng)過幾十年的努力,陸續(xù)建立了多種表征分析方法。

以色譜法與質(zhì)譜法為核心的檢測技術(shù),是當(dāng)前唾液酸表征分析研究中最主要且應(yīng)用最廣泛的方法[15-17]。然而在通過色譜法、質(zhì)譜法分析天然唾液酸時(shí),經(jīng)常遭遇檢測靈敏度低、結(jié)構(gòu)易被破壞、色譜分離度差等問題,因此在樣品前處理過程中,通常需要將唾液酸衍生化。衍生化的優(yōu)勢包括提高檢測靈敏度,穩(wěn)定唾液酸結(jié)構(gòu),增強(qiáng)色譜分離度,改變碎片化模式,強(qiáng)化結(jié)構(gòu)特征等。本文將重點(diǎn)對用于色譜與質(zhì)譜分析唾液酸的衍生方法進(jìn)行歸納和總結(jié),并展望該領(lǐng)域的應(yīng)用前景及發(fā)展趨勢等。

生物體內(nèi)的唾液酸,一部分以游離的形式存在;另一部分則經(jīng)常作為糖綴合物(glycoconjugates)的組成結(jié)構(gòu),以多種方式連接于其末端[18,19]。這使得關(guān)于唾液酸的色譜與質(zhì)譜分析方法大體上可分成4個(gè)層次,即單糖水平、寡糖水平、糖肽水平和糖蛋白水平。目前而言,在糖肽及糖蛋白等高水平上表征唾液酸仍然面臨極大困難,因而大部分衍生方法主要應(yīng)用于單糖與寡糖水平上。本文將從單糖、游離唾液酸、N/O-聚糖、糖脂等4個(gè)層面總結(jié)唾液酸的衍生方法。

1 單糖水平的唾液酸衍生方法

1.1 鄰苯二胺類試劑

連接于糖綴合物上的唾液酸能夠通過酸解、酶解等方法被解離[20,21]。解離后,唾液酸分子中的α-酮基-羧基能夠與鄰苯二胺類試劑的氨基發(fā)生反應(yīng),從而形成一種喹喔啉衍生物(見圖2)。在水溶液中,唾液酸能夠以α-吡喃糖、β-吡喃糖、非環(huán)狀酮等多種形式存在(以β-吡喃糖形式為主)[22]。而上述衍生方法的一個(gè)重要優(yōu)勢在于反應(yīng)生成的喹喔啉衍生物能夠消除端基異構(gòu)體,防止單一結(jié)構(gòu)在色譜分離時(shí)因異頭碳而產(chǎn)生多色譜峰。因衍生物具有熒光效應(yīng),故此方法常用于唾液酸的液相色譜-熒光檢測分析中[15]。與此同時(shí),衍生后的唾液酸能夠呈現(xiàn)出更好的色譜分離度和質(zhì)譜電離效率,使得其在唾液酸的液相色譜-質(zhì)譜分析中也有較為廣泛的應(yīng)用[3,15,23]。

圖2 唾液酸與鄰苯二胺反應(yīng)生成喹喔啉衍生物的示意圖

已報(bào)道的鄰苯二胺類試劑主要包括鄰苯二胺(o-phenylenediamine, OPD)、3,4-二氨基甲苯(3,4-diaminotoluene, DAT)、1,2-二氨基-4,5-二甲氧基苯(1,2-diamino-4,5-dimethoxybenzene, DDB)、4,5-二甲基-1,2-苯二胺(4,5-dimethylbenzene-1,2-diamine, DMBA)、4,5-亞甲二氧基-1,2-苯二胺(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine, DMB)等(見圖2)[24-28]。其中,DMB因具有熒光信號強(qiáng)、能夠顯著提高色譜分離度等優(yōu)勢,成為在單糖水平上衍生唾液酸的首選衍生試劑[15],相關(guān)方法已經(jīng)被開發(fā)成商業(yè)化試劑盒。相較于DMB,其他鄰苯二胺類試劑具有價(jià)格低廉、易獲得同位素標(biāo)記物等優(yōu)勢,同樣具有重要的應(yīng)用價(jià)值。值得注意的是,此類試劑也可以和其他α-酮酸發(fā)生反應(yīng),例如α-酮戊二酸、丙酮酸、對羥基苯丙酮酸等。因此在對生物樣品進(jìn)行直接衍生分析時(shí)需要注意信號干擾等問題[15]。

鄰苯二胺類試劑衍生的唾液酸在串聯(lián)質(zhì)譜分析中能夠產(chǎn)生特征性碎片離子。以被DMB衍生的唾液酸為例,其可以產(chǎn)生m/z313、295、283、229等碎片離子,有利于唾液酸的鑒別[3,29]。此類試劑衍生的唾液酸,即便含有不同的修飾基團(tuán),其碎片化模式依然非常相似,難以通過質(zhì)譜有效辨別不同結(jié)構(gòu)。因而在鑒定同分異構(gòu)體、修飾基團(tuán)的連接位置等方面，此方法應(yīng)用性不強(qiáng)。

鄰苯二胺類試劑衍生方法的主要缺陷有兩點(diǎn):樣品濃度會隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢,這意味著衍生過程伴隨著未知的副反應(yīng);同一條件對不同唾液酸的衍生效率并不完全相同,存在衍生歧視的風(fēng)險(xiǎn)[28,30-32]。這些問題導(dǎo)致此類試劑在唾液酸混合物的定量分析研究中存在局限性。

圖3 苯胺類試劑衍生唾液酸的示意圖

1.2 苯胺類試劑

標(biāo)記唾液酸的代表性苯胺類試劑為2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC),其通過還原胺化作用與唾液酸的α-酮基發(fā)生反應(yīng)[33,34]。然而,常規(guī)的還原胺化反應(yīng)條件易引起脫羧作用,從而導(dǎo)致生成大量相對分子質(zhì)量減少44的產(chǎn)物,即衍生后的樣品中既包含完整產(chǎn)物,也存在中性丟失產(chǎn)物(見圖3),嚴(yán)重制約了此方法的應(yīng)用。為了盡可能提高產(chǎn)物的單一性,Szabo等[34]通過改變反應(yīng)條件以提高脫羧作用發(fā)生的概率,從而只生成中性丟失產(chǎn)物。除AMAC外,7-氨基萘-1,3-二磺酸(7-aminonaphtalene-1,3-disulfonic acid)、4-氨基苯磺酸(4-aminobenzene sulfonic acid)等苯胺類試劑也已被用于衍生唾液酸。不同之處在于,這些試劑的磺酸基具有強(qiáng)負(fù)電荷屬性,主要用于毛細(xì)管電泳以及負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析[35,36]。

1.3 甲基化試劑

在強(qiáng)堿性條件下,通過碘甲烷(methyl iodide)將分子中羥基、羧基、氨基上的氫原子用甲基取代,是最早建立的唾液酸衍生方法之一[37],一般稱之為全甲基化方法。全甲基化方法自建立后又多次被優(yōu)化,目前仍然是衍生寡糖的重要方法之一[16]。另一類甲基化方法則先衍生羧基,然后再衍生羥基等其他基團(tuán)。例如,在用氯化氫的甲醇溶液將羧基甲基化后,可以通過乙酸酐吡啶溶液(acetic anhydride pyridine)、雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)等試劑將唾液酸分子乙?；蚬柰榛痆38,39]。但是自鄰苯二胺類試劑被廣泛應(yīng)用后,上述方法已較少用于單糖水平上的唾液酸分析,而且苛刻的反應(yīng)條件易破壞唾液酸的某些修飾基團(tuán)[40],進(jìn)一步限制了相關(guān)方法的應(yīng)用。

另有一種兩步衍生方法，先用重氮甲烷(diazomethane)衍生羧基后，再用七氟丁酸(heptafluorobutyric acid)衍生羥基。該反應(yīng)的生成物既可以保留唾液酸的修飾基團(tuán)(如乙?；?、甲基等),又可在氣相色譜-質(zhì)譜分析中產(chǎn)生特征性碎片離子,有利于鑒定修飾基團(tuán)的連接位置以及同分異構(gòu)體等[41,42]。此方法具有反應(yīng)速率高且生成物穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢,但由于重氮甲烷存在不穩(wěn)定性和高危險(xiǎn)性,使其應(yīng)用受到了限制。

1.4 烷基胺類試劑

苯胺類試劑主要和唾液酸的α-酮基發(fā)生反應(yīng),而烷基胺類試劑則通常被用于衍生羧基,已報(bào)道的試劑包括十七氟癸胺(heptadecafluoroundecylamine, HFUA)、4-(N,N-二甲基氨基)-7-(2-氨基乙基氨基)-2,1,3-苯并惡二唑(4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-(2-aminoethylamino)-2,1,3-benzoxadiazole)、4-(N,N-二甲基氨基)-7-哌嗪子基-2,1,3-苯并惡二唑(4-(N,N-dimethylaminosulfonyl)-7-piperazino-2,1,3-benzoxadiazole)等[43-45]。此類試劑能夠同時(shí)衍生唾液酸及其氧化產(chǎn)物,例如NeuAc及其氧化產(chǎn)物4-(乙酰氨基)-2,4-二脫氧-D-甘油-D-半乳糖辛酸(4-(acetylamino)-2,4-dideoxy-D-glycero-D-galacto-octonic acid, ADOA)可以用于評估生物體遭受的氧化壓力等[44]。以HFUA為代表的含氟衍生試劑,因其衍生物可以特異性地保留在含氟固定相的色譜柱上,并與樣品中的其他非氟組分分離,故而能夠有效減少液相色譜以及LC-MS分析中的干擾信號[45]。

與苯胺類試劑相似,烷基胺類試劑無法消除端基異構(gòu)體,使得單一唾液酸易形成多個(gè)色譜峰,大大增加了色譜圖的復(fù)雜性[45]。先消除端基異構(gòu)體再衍生唾液酸是一種可行的方案。已有文獻(xiàn)[46]報(bào)道,唾液酸能夠被雙氧水氧化從而轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬Ψ肿淤|(zhì)量減少28的產(chǎn)物,即ADOA,此產(chǎn)物無端基異構(gòu)體,或許可以在胺類試劑衍生唾液酸的研究中發(fā)揮重要作用。

2 游離唾液酸的衍生方法

糖綴合物上的唾液酸在衍生反應(yīng)過程中可能發(fā)生解離,從而干擾游離唾液酸的定量分析,而使用苯二胺類試劑衍生游離唾液酸的關(guān)鍵在于選擇合適的反應(yīng)條件以抑制解離的發(fā)生。最常用的鄰苯二胺類試劑是DMB,典型的衍生條件是在酸性環(huán)境下保持50 ℃恒溫2.5 h;改變條件至4 ℃并延長反應(yīng)時(shí)間至48 h,即可有效衍生樣品中游離的唾液酸[18]。DMBA也可以通過類似方法抑制解離并衍生游離的唾液酸[47]。

上述方法現(xiàn)已成為分析游離唾液酸的常規(guī)策略,除此之外,近些年也有其他方法被報(bào)道[27,48]。氯化氫的正丁醇溶液可以直接衍生游離唾液酸,此反應(yīng)在無水條件下進(jìn)行以抑制糖綴合物上的唾液酸發(fā)生解離[48]。先從樣品中分離游離的唾液酸,再進(jìn)行衍生化處理,這也是一種有效的分析策略[27,49]。雖然此方法操作復(fù)雜,但適用性更廣泛。采取簡化前處理的方式,通過在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜分析也可以直接分析游離的唾液酸[50]。

3 在N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法

寡糖是一種由幾個(gè)至幾十個(gè)單糖單元聚合而成的碳水化合物,經(jīng)常作為糖綴合物的重要組成部分通過多種途徑參與生物體的生理功能。一般而言,可以將寡糖分為4大類:N-聚糖(N-glycan)、O-聚糖(O-glycan)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan)和糖脂(glycosphingolipid)[51]。其中,糖胺聚糖很少被唾液酸化(sialylation),目前僅在硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate)中發(fā)現(xiàn)了此現(xiàn)象[52-54];其他寡糖則經(jīng)常發(fā)生唾液酸化。因此,本文不討論糖胺聚糖,僅從N-聚糖、O-聚糖和糖脂的層面總結(jié)在寡糖水平上的唾液酸衍生方法。

N-聚糖連接于蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基上,O-聚糖主要連接于蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸殘基上,二者結(jié)構(gòu)較為相似,衍生方法基本可以通用。在N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法,除至今仍被廣泛使用的全甲基化外,近些年來又相繼發(fā)展了以醇類、胺類試劑為核心的方法[16]。已有較為全面的文獻(xiàn)[16,55]總結(jié)了這些方法的原理,本文僅從衍生試劑的角度歸納并補(bǔ)充相關(guān)內(nèi)容。

3.1 醇類試劑

在有偶聯(lián)劑存在的情況下,甲醇/乙醇能夠與唾液酸的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)[56,57]。該反應(yīng)對連接位置不同的唾液酸具有很高的選擇性。如前文所述,唾液酸經(jīng)常連接于糖蛋白的末端,且與糖鏈的連接方式也較為多樣化,尤以α2,3-與α2,6-連接最為常見。其中,以α2,6-連接的唾液酸的羧基能夠與醇類衍生試劑發(fā)生酯化反應(yīng);以α2,3-連接的唾液酸則能夠與相鄰的單糖殘基(通常是半乳糖)發(fā)生縮合反應(yīng),生成內(nèi)酯。衍生反應(yīng)的高選擇性使得糖鏈產(chǎn)生結(jié)構(gòu)差異與相對分子質(zhì)量差異,有利于在色譜與質(zhì)譜分析中鑒定唾液酸的連接方式。以甲醇衍生為例,如果糖鏈中存在α2,6-連接的唾液酸,則相對分子質(zhì)量增加14(見圖4a);如果糖鏈中存在α2,3-連接的唾液酸,則相對分子質(zhì)量減少18(見圖4b)[57]。此類方法通過相對分子質(zhì)量差異鑒別不同連接方式的唾液酸,一般稱之為“連接特異性”(linkage-specific)衍生方法。

圖4 唾液酸的連接特異性衍生示意圖

3.2 胺類試劑

與醇類試劑相似,以甲胺、二甲胺、異丙胺等為代表的胺類試劑也可以在無水條件下與α2,3-、α2,6-連接的唾液酸發(fā)生特異性反應(yīng)。其中,α2,6-連接的唾液酸發(fā)生羧基酰胺化反應(yīng);α2,3-連接的唾液酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng),通過質(zhì)譜分析衍生后的糖鏈就可以鑒定唾液酸的連接方式[58,59]。截至目前,已經(jīng)被用于連接特異性衍生的試劑有10余種,不同試劑的衍生效果存在一些差異性,以異丙胺的特異性最高[59]。值得注意的是,連接特異性的衍生方法主要適用于樣品中僅含有α2,3-與α2,6-連接的唾液酸,而對于α2,8-連接的結(jié)構(gòu),其能與相鄰?fù)僖核岬牧u基發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng)(見圖4c),模式與α2,3-連接的唾液酸較為相似[60]。

α2,3-連接的唾液酸形成的內(nèi)酯穩(wěn)定性不高,連接特異性的衍生方法被進(jìn)一步優(yōu)化,通過兩步反應(yīng)依次衍生α2,6-與α2,3-連接的唾液酸。在第一步反應(yīng)中,α2,6-連接的唾液酸被酯化或胺化,α2,3-連接的唾液酸被內(nèi)酯化;在第二步反應(yīng)中,內(nèi)酯化的唾液酸開環(huán)后被其他胺類試劑繼續(xù)衍生[59,61]。兩步反應(yīng)既保證了衍生產(chǎn)物的特異性,也增強(qiáng)了其穩(wěn)定性,逐漸成為表征酸性N/O-聚糖的常用方法之一。

胺類試劑的特異性衍生作用通常在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑存在的情況下發(fā)生。若改變反應(yīng)條件則可以消除這種特異性,例如,在1-羥基苯并三唑不存在的情況下,甲胺、甲苯胺可以同時(shí)胺化α2,3-、α2,6-和α2,8-連接的唾液酸[60,62,63]

3.3 肼類試劑

與胺類試劑相似,肼類試劑也可以與唾液酸的羧基發(fā)生縮合反應(yīng),生成酰肼衍生物。事實(shí)上,已有多種肼類試劑被用于衍生寡糖的還原端,但用于衍生唾液酸的試劑仍然不多,主要為乙酰肼(acetohydrazide)[40]。另一種肼衍生方法則是由羥基在強(qiáng)氧化劑作用下生成的酮基與肼類試劑發(fā)生反應(yīng)[64]。當(dāng)氧化劑高碘酸鈉的濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí),寡糖的末端殘基均可與肼反應(yīng);若降低高碘酸鈉的濃度至1 mmol/L,則只有糖鏈末端的唾液酸殘基與肼反應(yīng),通過此方法可以選擇性富集唾液酸化的糖肽[15,65]。

4 在糖脂水平上的唾液酸衍生方法

糖脂是一類由寡糖與脂類共價(jià)連接而成的糖綴合物,部分糖脂的糖鏈末端含有唾液酸殘基,以神經(jīng)節(jié)苷脂(ganglioside)最為典型。神經(jīng)節(jié)苷脂大量存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,參與眾多生理過程,并在一些疾病中發(fā)揮重要作用[6,66]。一般而言,通過質(zhì)譜的負(fù)離子模式可以直接分析唾液酸化的糖脂[67,68],不過,因衍生后的糖脂在提高色譜分離度以及穩(wěn)定唾液酸殘基等方面具有一些優(yōu)勢,故衍生化方法在相關(guān)研究中也有較為廣泛的應(yīng)用。

4.1 甲基化試劑

全甲基化方法于20世紀(jì)60年代已被用于衍生糖脂,現(xiàn)如今仍然是重要的糖脂衍生方法之一[66,69,70]。常規(guī)的全甲基化方法會掩蓋天然分子中的甲基化修飾,研究者采用氘代碘甲烷衍生神經(jīng)節(jié)苷脂,并在藍(lán)指海星(Linckialaevigata)中發(fā)現(xiàn)了C8位置存在天然甲基化修飾的唾液酸[71]。全甲基化衍生一般需要在強(qiáng)堿性試劑(如氫氧化鈉)存在的情況下發(fā)生;若改變反應(yīng)條件,取消強(qiáng)堿性試劑,則碘甲烷主要與唾液酸的羧基反應(yīng)生成甲酯類物質(zhì)[72,73]。類似地,3-甲基-1-對甲苯基三氮(3-methyl-1-p-tolyltriazene)可以代替碘甲烷完成羧基的甲基化反應(yīng)[74,75]。相對于全甲基化方法而言,甲基化的反應(yīng)條件較為溫和,有利于抑制唾液酸殘基上的修飾基團(tuán)被破壞。值得注意的是,甲基化方法主要衍生α2,3-與α2,6-連接的唾液酸,而α2,8-連接的唾液酸易在反應(yīng)過程中被內(nèi)酯化[60],通過此現(xiàn)象應(yīng)當(dāng)可以特異性地鑒別α2,8-連接的結(jié)構(gòu)。

4.2 胺類試劑

近些年來,胺化反應(yīng)逐漸被引入到唾液酸化糖脂的色譜與質(zhì)譜分析中。胺化試劑與羧基發(fā)生縮合反應(yīng)后能夠?qū)⑺嵝曰鶊F(tuán)中性化,有利于穩(wěn)定唾液酸殘基。糖脂被2-(2-吡啶胺)乙胺(2-(2-pyridilamino)ethylamine)衍生后,一方面能夠產(chǎn)生熒光從而便于通過液相色譜-熒光檢測方法分析;另一方面也可以改變二級質(zhì)譜的碎片化模式,有利于簡化譜圖。對于烷基胺類試劑而言,其在無水條件下可以衍生唾液酸。而最近一項(xiàng)研究[60]表明,甲胺、乙胺等試劑在水溶液中依然可以高效率衍生唾液酸化糖脂;與之相對,異丙胺、二甲胺等試劑在相同條件下卻幾乎不與羧基反應(yīng)。連接特異性的衍生方法也適用于糖脂,其中,α2,6-連接的唾液酸發(fā)生羧基酰胺化反應(yīng);α2,3-與α2,8-連接的唾液酸發(fā)生內(nèi)酯化反應(yīng),而內(nèi)酯化的唾液酸在開環(huán)后可以繼續(xù)被其他胺類試劑衍生[60]。

在1 mmol/L高碘酸鈉存在的情況下,唾液酸殘基的C7與C8鍵斷開后生成酮基,生成的酮基可被胺類試劑進(jìn)一步衍生,近期文獻(xiàn)[76]報(bào)道了一種基于此操作的同整質(zhì)量標(biāo)記(isobaric tag)[77]唾液酸化糖脂的方法。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag)通常被用于標(biāo)記多肽、N/O-聚糖的還原端[78,79],上述方法則創(chuàng)新性地將其拓展應(yīng)用于標(biāo)記糖脂。不過,此方法會破壞唾液酸殘基的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)鍵的生物學(xué)信息被丟失。

5 結(jié)論與展望

經(jīng)過幾十年的發(fā)展,研究者們已經(jīng)建立了多種唾液酸衍生方法,以便增強(qiáng)對其生物功能的認(rèn)識。但開發(fā)新的衍生方法與檢測技術(shù)仍然是當(dāng)前糖生物學(xué)領(lǐng)域的重要話題與關(guān)鍵任務(wù)。

單糖水平上的唾液酸衍生方法應(yīng)當(dāng)致力于解決如下幾個(gè)問題:第一,減少副反應(yīng)的發(fā)生;第二,消除目標(biāo)分子的端基異構(gòu)體等;第三,增強(qiáng)修飾基團(tuán)的連接位點(diǎn)與同分異構(gòu)體鑒別能力;第四,發(fā)展同位素標(biāo)記等相對定量分析技術(shù)。N/O-聚糖水平上的唾液酸衍生方法相對成熟,當(dāng)前主要面臨色譜分離度與檢測靈敏度不能滿足需求的問題,以及相關(guān)方法沒有得到規(guī)范化應(yīng)用等問題。糖脂水平上的衍生技術(shù)則需要考慮:第一,建立能夠改善待測分析物分子的碎片化模式的方法;第二,將N/O-聚糖衍生方法推廣到本領(lǐng)域內(nèi);第三,建立溫和的同位素標(biāo)記方法。