張宇璠韓瑩瑤蘇雄偉紀(jì)志峰左志段磊

表面羧基化對聚合物微氣泡性能的影響*

張宇璠①韓瑩瑤①蘇雄偉①紀(jì)志峰①左志①段磊①

目的：探討左旋聚乳酸（PLLA）及聚乙烯醇（PVA）為膜材的聚合物微氣泡表面羧基化，對其形貌、粒徑、穩(wěn)定性及超聲成像性能的影響。方法：首先對PVA膜材進(jìn)行了羧基化修飾，通過紅外光譜進(jìn)行羧基化程度的表征。然后用羧基化前、后的PVA為原料分別制備了聚合物微氣泡，光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡（SEM）觀察微氣泡形貌，Zeta電位檢測微氣泡表面電荷特性，并對羧基化前后的微氣泡進(jìn)行體外超聲成像實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：羧基化不會顯著影響微氣泡的粒徑，但會改變其表面結(jié)構(gòu)，形成諸多凹陷；Zeta電位檢測表明，羧基的引入使微氣泡的表面電荷向負(fù)電性移動，微氣泡羧基化之后能夠顯著增強(qiáng)超聲成像效果，延長超聲成像時(shí)間。結(jié)論：羧基的引入既由于靜電斥力提高了微氣泡的穩(wěn)定性，又可賦予其耦聯(lián)其他活性物質(zhì)的能力，并可顯著增強(qiáng)其超聲成像效果。本研究為微氣泡的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

微氣泡；聚合物；超聲成像

為了得到更準(zhǔn)確、更及時(shí)、更豐富的醫(yī)學(xué)影像學(xué)信息，需要合適的造影劑進(jìn)行輔助[1]。在超聲診斷成像中所用的造影劑主要是微氣泡造影劑，其膜材種類、粒徑大小、結(jié)構(gòu)形貌、穩(wěn)定性等性質(zhì)對超聲成像性能均會造成很大的影響[2-3]。

常用超聲微氣泡造影劑膜殼材料有白蛋質(zhì)類、脂質(zhì)體類及聚合物類等[4]。后者相比于前兩者，具有較強(qiáng)的分子間作用力，制備的微氣泡具有較厚的膜殼，可以抵抗外界環(huán)境中各因素的破壞，在體內(nèi)循環(huán)持續(xù)時(shí)間長，因此被認(rèn)為是更穩(wěn)定的超聲造影劑[5-7]。同時(shí)，較厚的膜殼也使得聚合物微氣泡更容易包封或承載一些活性物質(zhì)，如藥物、抗體等，從而成為集診斷、靶向及治療為一體、高效以及多模態(tài)、多功能方向的微氣泡[8-15]。

表面羧基化是在一些粒子表面引入羧基，使其可以與很多基團(tuán)，例如羥基、氨基等發(fā)生化學(xué)耦聯(lián)，從而增大其應(yīng)用空間，并提高其生物相容性及穩(wěn)定性[16]。已有研究人員在磁性納米粒子、微球、微囊等粒子表面進(jìn)行羧基化修飾，取得了良好的效果[17-18]。對微氣泡表面進(jìn)行羧基化修飾的研究相對較少[19-20]。對羧基化之后微氣泡的形貌結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、超聲成像效果進(jìn)行深入探討的文章仍然很少。

本論文以左旋聚乳酸（poly l-lactic acid，PLLA）及聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）為膜材的聚合物微氣泡為研究對象，對其膜殼材料PVA進(jìn)行了羧基化修飾（圖1），對制得羧基化微氣泡的物化性質(zhì)進(jìn)行表征，并進(jìn)一步探究羧基化修飾對微氣泡超聲成像性能的影響，現(xiàn)具體報(bào)道如下。

圖1 微氣泡羧基化示意圖

1 材料與方法

1.1 材料 PVA：分析純，重均分子量Mw=31 000，德國西格瑪奧德里奇中國有限公司；PLLA：分析純，重均分子量Mw=30 000，濟(jì)南健寶開元生物材料有限公司；高碘酸鈉（NaIO4）：分析純，廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心；亞氯酸鈉（NaClO2）：分析純，上海晶純試劑有限公司；吐溫80：化學(xué)純，海光鏵科技有限公司；司班80：化學(xué)純，山海久億化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷（CHCl3）、冰醋酸（CH3COOH）、鹽酸（HCl）均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 PVA羧基化 PVA單體中的1，2-乙二醇結(jié)構(gòu)，可以被高碘酸或者高碘酸鹽特異性斷裂，進(jìn)而氧化，在鏈的末端形成醛基，而當(dāng)亞氯酸鹽與醛基的摩爾比為4∶1時(shí)，有把其氧化成羧基的最高效率[15]。基于這個(gè)原理，可以對PVA進(jìn)行羧基化修飾。具體步驟如下：將5 g PVA粉末加入100 mL二次水，溶脹過夜，再放入80 ℃水浴中加熱，適當(dāng)攪拌，至溶液完全澄清透明，配制出濃度為5%（w/v）的PVA水溶液。將溶液冷卻至室溫，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值約為4，加入0.55 g高碘酸鈉粉末，60 ℃水浴，攪拌反應(yīng)約7 h。高碘酸鈉反應(yīng)完全后，將溶液迅速冷卻至室溫，醋酸調(diào)節(jié)pH值至3，再加入3.7 g亞氯酸鈉粉末，靜置5 h后，此時(shí)pH值約變?yōu)?，溶液由無色變?yōu)槌赛S色，表明反應(yīng)的進(jìn)行。

1.2.2 微氣泡的制備 分別以羧基化及未羧基化的PVA為原料，采用雙重乳液/溶劑蒸發(fā)法制備微氣泡[16-17]。具體過程如下：精確稱取0.15 g PLLA加入10 mL的CHCl3中，再加入1 mL二次水以及3～4滴司班80試劑，用細(xì)胞粉碎儀（SONIFIER S250D，美國BRANSON公司數(shù)字型細(xì)胞破碎儀）以80 W的功率，25%的占空比乳化40 s，得到乳白色均勻液體。用滴管將其均勻緩慢加入5%（w/v）PVA水溶液30 mL中，同時(shí)用精密增力電動攪拌機(jī)（JJ-1，常州國華電器有限公司）以2000 r/min的速度均勻攪拌。再加入3～4滴吐溫80試劑，攪拌4 h，靜置并收集制得的微囊。并以3000 r/min離心10 min保留所得沉淀。加入二次水洗滌并以相同轉(zhuǎn)速離心直至上清液無色透明，收集沉淀分別得到羧基化及未羧基化的聚合物微囊。在微囊中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的甘露醇，用冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）進(jìn)行凍干，干燥完成后以4 mL/min的速度充入氮?dú)猓闯蔀槲馀輧龈煞蹣悠?。用上述方法分別制備了羧基化及未羧基化的微氣泡。

1.2.3 表征 用紅外光譜儀（Nicolet5700，美國Thermo Fisher公司）對羧基化前后的PVA進(jìn)行紅外吸收光譜（FTIR）檢測；采用光學(xué)顯微鏡（BM1000，南京江南永新光學(xué)公司），掃描電鏡（Ultra Plus，德國Carl Zeiss）進(jìn)行微氣泡形貌的研究；用Zeta電位檢測儀（美國Brookhaven）進(jìn)行微氣泡表面電荷特性檢測。

1.2.4 體外超聲顯影實(shí)驗(yàn) 體外超聲顯影實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)由小動物超聲影像系統(tǒng)（Vevo2100，加拿大VisualSonics公司）、自制的模擬人體聲學(xué)特性的體模組成。體模的制備方法如下：將適量瓊脂和二次水混合均勻并加熱至沸，放入甘油。其中瓊脂、甘油、二次水的比例為3∶4∶90。加熱至沸后持續(xù)30 min，期間酌情加入二次水。去除上層泡沫，將高溫液體倒入模具中，插入硅膠管。于室溫下靜置，待瓊脂完全凝固，抽去硅膠管，留下模擬人體血管的空隙。將制備好的羧基化及未羧基化的微氣泡凍干粉樣品重懸于二次水中，調(diào)節(jié)其濃度均為1×109個(gè)/mL，取2 mL置于體模管道中，分別用小動物超聲影像系統(tǒng)的25 MHz探頭進(jìn)行體外超聲顯影實(shí)驗(yàn)。當(dāng)超聲成像圖片中的特定區(qū)域（region of interest，ROI）選定后，超聲影像系統(tǒng)可自動計(jì)算該區(qū)域的平均灰度值，并實(shí)時(shí)給出平均灰度值隨時(shí)間的變化曲線。

2 結(jié)果

2.1 羧基化的定性分析 羧基化修飾前、后PVA樣品在1700 cm-1處和3500 cm-1處都有吸收峰，但是羧基化修飾的樣品（紅色曲線）明顯比未羧基化修飾的樣品（藍(lán)色曲線）羰基吸收峰更明顯，見圖2。

圖2 羧基化前后PVA的紅外光譜圖

2.2 羧基化對微氣泡穩(wěn)定性的影響 羧基化前后微氣泡的分散穩(wěn)定性發(fā)生了改變。羧基化修飾之后的微氣泡有更好的分散性，不易團(tuán)聚，可以更加均勻持久地分散于液態(tài)介質(zhì)中，這有利于其體內(nèi)外應(yīng)用。為了進(jìn)一步微氣泡穩(wěn)定性進(jìn)行表征，測定了羧基化前后微氣泡的Zeta電位，未羧基化微氣泡的Zeta電位為（-20±2.09）mV，羧基化微氣泡的Zeta電位為（-50±2.11）mV。

2.3 羧基化對微氣泡微觀形貌的影響 從光學(xué)顯微鏡及SEM的結(jié)果（圖3）可以看出，羧基化前后的微氣泡粒徑分布并無明顯差別，均在1～2 μm左右，羧基化修飾前后的微氣泡均為球形，未羧基化微氣泡表面光滑，而羧基化修飾的微氣泡表面出現(xiàn)許多明顯小凹陷。

圖3 羧基化前后微氣泡的光學(xué)顯微鏡及SEM結(jié)果

2.4 羧基化對微氣泡超聲成像性能的影響 與陰性對照組二次水相比，羧基化前后的微氣泡均可以引起超聲回波信號增強(qiáng)，使顯影區(qū)域灰度值明顯增加，而羧基化之后的微氣泡具有更好的超聲顯影增強(qiáng)效果（圖4a）。與二次水相比，兩種微氣泡均可使體模管道部位的超聲圖像亮度得到增強(qiáng)，隨時(shí)間的推移，在超聲場作用下，微氣泡會逐漸發(fā)生團(tuán)聚、破裂等現(xiàn)象，導(dǎo)致超聲圖像亮度逐漸減弱。其中，羧基化修飾后的微氣泡具有更加優(yōu)良的超聲成像效果，能在較長的時(shí)間內(nèi)使超聲圖像保持高灰度值（圖4b）。

圖4 羧基化前后微氣泡的超聲成像結(jié)果

3 討論

對聚合物微氣泡進(jìn)行羧基化修飾就是將膜材PVA的羥基氧化成羧基。羧酸（RCOOH）的吸收峰有3000～3750 cm-1處氫氧鍵（O-H）和1600～1900 cm-1處碳氧雙鍵（C=O）兩個(gè)峰。找到并分析這兩個(gè)峰就可實(shí)現(xiàn)對羧基化修飾過的微氣泡進(jìn)行定性分析。本研究結(jié)果顯示羧基化修飾的樣品明顯比未羧基化修飾的樣品羰基吸收峰更明顯，表明PVA確實(shí)被羧基化。

Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，是對顆粒之間相互排斥或吸引力強(qiáng)度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta電位的絕對值越高，說明其所帶同種電荷越多，粒子間靜電斥力越大，體系越穩(wěn)定；反之，Zeta電位的絕對值越低，體系越傾向于凝結(jié)或凝聚，越不穩(wěn)定。從表1中可以看出，雖然羧基化修飾前后的微氣泡樣品均帶負(fù)電，但羧基化修飾之后的微氣泡Zeta電位絕對值明顯升高，這是因?yàn)轸然男揎椧肓烁嗟呢?fù)電荷，因此提高了微氣泡之間的靜電斥力，很好地提高了微氣泡在液態(tài)介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性。

本研究中，羧基化前后的微氣泡粒徑分布并無明顯差別，說明是否羧基化修飾對微氣泡粒徑影響不大。未羧基化微氣泡表面光滑，而羧基化修飾的微氣泡表面出現(xiàn)許多明顯小凹陷，這可能是因?yàn)轸然揎椄淖兞烁叻肿泳酆衔锏逆湺谓Y(jié)構(gòu)和狀態(tài)，影響了PVA的物化性質(zhì)，從而影響了微氣泡表面的粘彈性，帶來了微氣泡表面形貌的改變。而微氣泡粘彈性及形貌的變化必定會影響超聲成像時(shí)的某些聲學(xué)或動力學(xué)特性，從而可能引起超聲成像結(jié)果的改變。

羧基化之后的微氣泡具有更好的超聲顯影增強(qiáng)效果，羧基化修飾后的微氣泡具有更加優(yōu)良的超聲成像效果，能在較長的時(shí)間內(nèi)使超聲圖像保持高灰度值。這一方面可能是因?yàn)轸然揎椄淖兞宋馀莸谋砻嫘蚊?，使其表面出現(xiàn)很多凹陷（圖3d），表面形貌的改變顯然會影響微氣泡在超聲場中的回波特性，影響其聲學(xué)或動力學(xué)特性，如改變微氣泡縮放特性、非線性效應(yīng)等從而使微氣泡在超聲場下的顯影效果得到提高；另一方面，羧基化修飾提高了微氣泡的分散穩(wěn)定性，使其能均勻穩(wěn)定的分布于液態(tài)介質(zhì)中，從而增強(qiáng)了超聲成像的時(shí)間穩(wěn)定性。

綜上所述，羧基化修飾會影響微氣泡表面形貌，但不會改變其粒徑分布。同時(shí)羧基化修飾使微氣泡的Zeta電位絕對值增加，提高了其在液態(tài)介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性。表面形貌和穩(wěn)定性的改變影響了微氣泡的聲學(xué)性質(zhì)，使得羧基化修飾過的微氣泡的超聲顯影效果明顯好于未羧基化修飾的微氣泡，且顯影持續(xù)時(shí)間延長，更有利于微氣泡的體內(nèi)應(yīng)用。此外，羧基化修飾也為微氣泡耦聯(lián)其他物質(zhì)提供了可能，如通過化學(xué)耦聯(lián)抗體則可實(shí)現(xiàn)靶向分子顯影；耦聯(lián)藥物或者基因，可用于疾病治療，實(shí)現(xiàn)診療一體化。

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Influence of Carboxyl Modification on the Surface of Polymer Microbubbles

ZHANG Yu-fan，HAN Yingyao，SU Xiong-wei，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（33）：007-010

Objective：To explore the influence of carboxylation on the surface of polymer MBs which made up of poly l-lactic acid and polyvinyl alcohol（PVA）on the morphology，size，stability and ultrasound imaging.Method：Firstly，the PVA was modified by carboxyl and the degree of PVA carboxylation was characterized by infrared spectroscopy.The polymer MBs were prepared by using PVA before and after carboxylation.The morphology of MBs were observed by optical microscope and scanning electron microscope.The unique electric charge characteristics of MBs surface were detected by Zeta potential detection.Finally，the ultrasound imaging experiments in vitro with MBs were performed before and after carboxyl.Result：Carboxylation didn’t affect particle size but affect morphology signally and changed the structure on the surface such as the formulation of hollows.Zeta potential detection indicated carboxylation made the surface charge of MBs move to electronegative place.Carboxylation could signally enhance the effect and extend the time of ultrasonic imaging after carboxyl.Conclusion:The introduction of carboxyl give MBs the ability of coupling other active substances as well as enhancing the stability of MBs because of electrostatic repulsion.It can also signally enhance the effect of ultrasonic imaging.This study lay a good foundation for the biomedical application of MBs.

Microbubble；Polymer；Ultrasound imaging

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.33.003

2015-09-05） （本文編輯：王利）

國家自然科學(xué)基金青年基金支持（61401217）；

江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練基金項(xiàng)目支持（201510312046Y）

①南京醫(yī)科大學(xué) 江蘇 南京 210029

段磊

First-author’s address：Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China