鄭蒙蒙, 韓 穎, 康經(jīng)武,*

(1.中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3.上?？萍即髮W(xué), 上海 201210)

近20年來(lái),質(zhì)譜法已成為大規(guī)模蛋白質(zhì)分析的核心方法?；谫|(zhì)譜的蛋白組學(xué)分析通常采用自下而上(bottom-up)的策略[1],需要將完整蛋白質(zhì)酶解成肽段后采用多維液相色譜-質(zhì)譜分析得到肽段的氨基酸序列,通過(guò)搜庫(kù)檢索鑒定蛋白質(zhì)[1,2]。在整個(gè)分析過(guò)程中,蛋白質(zhì)樣品的高效酶解是蛋白質(zhì)鑒定不可或缺的步驟。目前傳統(tǒng)的蛋白酶解方法為溶液酶解,整個(gè)過(guò)程需要持續(xù)12～24 h,耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,蛋白質(zhì)的快速酶解方法受到研究者們的廣泛關(guān)注,其中包括如多酶系復(fù)合作用,培育篩選高效酶種,技術(shù)輔助酶解等,其中以固定化酶技術(shù)最具代表性[3,4]。與溶液酶解方法相比,固定化酶技術(shù)克服了游離酶穩(wěn)定性低、難以與底物蛋白質(zhì)分離等缺點(diǎn)。由于多孔材料的限閾作用[5],胰蛋白酶在微反應(yīng)器中的局部濃度顯著提高,提升了酶解效率。

在眾多的固定化酶技術(shù)研究中,常用的載體有毛細(xì)管柱[6,7]、微流控芯片[8,9]、磁性微球[10-13]、納米多孔材料[14-16]和溶膠-凝膠[17]等。受材料性質(zhì)的影響,酶固定化載體也存在自身的優(yōu)缺點(diǎn),如微流控芯片易于攜帶,小型化,可減少樣品與試劑的消耗量,但較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化[18];磁性微球雖然簡(jiǎn)化了樣品分離過(guò)程,但微球本身易團(tuán)聚,表面容易產(chǎn)生不可逆吸附,酶負(fù)載量低[10];納米多孔材料比表面積大,可固載大量的胰蛋白酶,但制備與化學(xué)修飾過(guò)程繁瑣[19]。

20世紀(jì)90年代初,Hjerten等[20]、Svec和Frechet[21]分別提出了“有機(jī)聚合物整體柱”的概念,隨后各類(lèi)有機(jī)聚合整體柱被廣泛應(yīng)用于固定化酶技術(shù)研究中[22-24]。與其他載體相比,整體柱材料具有較大的貫穿孔道和比表面積,其特有的對(duì)流性能可增加樣品的傳質(zhì)效率,樣品與底物的接觸機(jī)會(huì),以及酶催化的速率[25]。整體柱材料制備簡(jiǎn)單,成本低廉,滲透性良好,機(jī)械強(qiáng)度高,是樣品處理和色譜分離的理想介質(zhì)[26]。2002年,Svec課題組[22]以甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、2-乙烯-4,4二甲基吖內(nèi)酯(VAL)為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑在微流體通道內(nèi)制備了poly(VAL-co-EDMA-co-HEMA)整體材料,用于胰蛋白酶的固定化及蛋白質(zhì)的快速酶解。2013年,Dovichi課題組[27]將毛細(xì)管區(qū)帶電泳與ESI-MS串聯(lián),并與固定化胰蛋白酶整體柱結(jié)合,成功地從3 ng小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)的細(xì)胞裂解液中鑒定到7個(gè)蛋白質(zhì)。同年,Krenkova等[28]將肽-N-糖苷酶F固定到修飾后的聚甲基丙烯酸酯整體柱上,用于多糖的分離檢測(cè)。但整體柱也存在分析通量不高的缺點(diǎn),且催化酶大多通過(guò)與甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)單體上的環(huán)氧基反應(yīng)被固定在基質(zhì)上[23,29],環(huán)氧基的開(kāi)環(huán)衍生化處理使實(shí)驗(yàn)變得耗時(shí)繁瑣。

為了解決以上問(wèn)題,本研究發(fā)展了光聚合的方式批量制備固定化酶整體小柱用于蛋白質(zhì)的快速酶解。該整體小柱采用4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯(PAS)、HEMA為功能單體,可與交聯(lián)劑、致孔劑在20 μL的移液器吸頭尖端原位聚合形成整體柱床。酶分子的氨基與琥珀酰亞胺酯反應(yīng)實(shí)現(xiàn)固定化,無(wú)需引入其他偶聯(lián)試劑與化學(xué)修飾。實(shí)驗(yàn)采用離心輔助的方式對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣、酶解、收集,簡(jiǎn)化了樣品處理的流程,減少了樣品的損失與污染。整個(gè)酶解過(guò)程高效省時(shí),可在10 min內(nèi)完成,且離心式、平行化的樣品處理方式顯著地提高了樣品的分析通量,十分適用于微量蛋白質(zhì)的快速酶解。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜-LTQ-Fleet離子阱質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)、EASY-nLC 1200納升級(jí)液相色譜-Thermo Orbitrap Fusion Tribrid高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀(Nano-LC-MS/MS)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司); Mini spin高速離心機(jī)、Concentrator plus真空離心濃縮儀(德國(guó)Eppendorf公司); BT25S分析天平、PB-20標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)(德國(guó)Sartorius公司); JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司); Rotavapor R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); S-4800型掃描電子顯微鏡(日本日立株式會(huì)社)。

胰蛋白酶(trypsin)、二甲基亞砜(DMSO)、十二醇(1-dodecanol)、二硫蘇糖醇(DTT)、甲酸(HCOOH,色譜純)、碘代乙酰胺(IAM)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);蛋白酶抑制劑(德國(guó)Roche公司);乙腈和甲醇(色譜純,德國(guó)Merck公司);細(xì)胞色素C(CYC)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);牛血清白蛋白(BSA)、碳酸氫銨、鹽酸(HCl)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(CH2Cl2)、氨水(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);季戊四醇三丙烯酸酯(PETA,美國(guó)Alfa Aesar公司); 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,上海安耐吉化學(xué)公司); 4-二甲氨基吡啶(DMAP,日本TCI公司);磷酸緩沖鹽溶液(PBS, pH=7.4)、Axygen?系列20 μL吸頭(上海生工生物工程股份有限公司); Sep-pack C18固相微萃取小柱(美國(guó)Waters公司); Pierce BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。Milli-Q去離子水由Millipore純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備得到。

人急性早幼粒白血病(NB4)細(xì)胞與人急性T細(xì)胞白血病(Jurkat T)細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。

1.2 固定化胰蛋白酶整體小柱的制備

1.2.1整體小柱的制備

4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯功能單體的制備:取4.5 gN-羥基琥珀酰亞胺,置于干燥的圓底燒瓶中,抽換氮?dú)?次后,加入150 mL二氯甲烷,攪拌均勻,加入3 mL戊烯酸,待白色顆粒溶解后再加入6.9 g EDC·HCl和4.0 g DMAP,室溫?cái)嚢?2 h,旋干,進(jìn)行柱層析分離,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后得到4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯白色晶體5.57 g,產(chǎn)率為94.3%。

整體小柱的制備:取20 μL的移液器吸頭適量,分別于乙醇、丙酮中各超聲10 min,自然風(fēng)干后,將柱頭封端。取0.090 5 g二苯甲酮[30],置于1 mL 1,4-丁二醇-甲醇(1∶1, v/v)中,混合均勻后用氮?dú)獯祾呷パ?。?0 μL上述溶液導(dǎo)入柱頭內(nèi),在氮?dú)獗Ｗo(hù)下,于365 nm紫外燈下照射15 min,重復(fù)3次。將功能單體PAS和HEMA、交聯(lián)劑PETA、致孔劑DMSO、DMF和十二醇按質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、7.4%、12.6%、33%、8%和34%的比例混合均勻,取7 μL于柱頭中,在紫外燈裝置中光照30 min。聚合結(jié)束后切去柱頭的封端,用乙腈沖洗以除去未反應(yīng)的功能單體和致孔劑,制得整體小柱,常溫保存。

1.2.2胰蛋白酶的固定化

用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽(pH 6.8)洗滌整體小柱3次,加入0.5 mg/mL 100 μL胰蛋白酶溶液(溶解于pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液),以2 000 r/min離心15 min,重復(fù)3次,然后用500 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)封閉未反應(yīng)的PAS基團(tuán)[19],于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.3 樣品制備與處理

1.3.1NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞培養(yǎng)

NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞均接種于含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37 ℃、含5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2的飽和濕度孵箱中懸浮培養(yǎng)。每隔48 h更換新的培養(yǎng)基,傳代培養(yǎng)。

1.3.2固定化酶整體小柱酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與細(xì)胞樣品

采用固定化酶整體小柱酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)時(shí),整體小柱先用50 mmol/L碳酸氫銨溶液洗滌3次,除去未鍵合的胰蛋白酶。取適量CYC與BSA,置于50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液中,分別配制成200 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取100 μL于固定化酶整體小柱內(nèi),以2 000 r/min離心酶解10 min,收集酶解液,進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

在酶解細(xì)胞樣品時(shí),配制10 mL裂解緩沖液(4.804 8 g尿素和0.039 5 g碳酸氫銨,以及一片蛋白酶抑制劑片劑溶于10 mL Milli-Q H2O中)。分別收集1×105個(gè)NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次,加入100 μL預(yù)冷的裂解緩沖液,在冰上以60 W功率超聲破碎2 min。然后以9 780 r/min離心10 min,收集上清液。采用Pierce BCA蛋白定量試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行定量。向蛋白質(zhì)溶液中加入終濃度為10 mmol/L的DTT溶液,置于37 ℃溫育1 h,隨后加入終濃度為5 mmol/L的IAM,并置于暗室中常溫反應(yīng)45 min。向蛋白質(zhì)溶液中加入50 mmol/L碳酸氫銨,將尿素濃度稀釋至1 mol/L。取稀釋后的細(xì)胞裂解液于固定化酶整體小柱中,以2 000 r/min離心酶解10 min,收集酶解液,通過(guò)Sep-pack C18固相微萃取柱脫鹽。酶解所得肽段進(jìn)行Nano-LC-MS/MS分析。

1.3.3溶液酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與細(xì)胞樣品

取適量CYC和BSA于50 mmol/L碳酸氫銨緩沖液中,分別配制成200 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,于100 ℃變性處理10 min。待標(biāo)準(zhǔn)樣品冷卻至室溫,以蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比為40∶1的比例加入胰蛋白酶,置于37 ℃水浴中酶解16 h。酶解結(jié)束后置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。酶解所得肽段進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

在酶解細(xì)胞樣品時(shí),預(yù)處理步驟同1.3.2節(jié),1×105個(gè)NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞經(jīng)超聲破碎、還原烷基化、樣品稀釋后,在樣品溶液中以蛋白質(zhì)與酶質(zhì)量比為40∶1的比例加入胰蛋白酶,置于37 ℃水浴中酶解16 h。酶解結(jié)束后通過(guò)Sep-pack C18脫鹽。酶解所得肽段進(jìn)行Nano-LC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品

標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品酶解后由Dionex Ultimate 3000液相色譜與LTQ-Fleet離子阱質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行肽段的分離與鑒定。

色譜條件:分析色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫為25 ℃;流動(dòng)相A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速為0.5 mL/min;梯度洗脫程序:0～25 min, 5%B～45%B; 25～30 min, 45%B～72%B; 30～40 min, 72%B。進(jìn)樣量為10 μL(標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為200 ng/μL)。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源,正離子模式;離子源電壓為3.0 kV;金屬毛細(xì)管溫度為275 ℃;一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為m/z300～1 800;二級(jí)質(zhì)譜中母離子的選擇采用數(shù)據(jù)依賴模式;碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量為35 eV。

數(shù)據(jù)檢索條件:由MaxQuant(1.5.4.1)軟件進(jìn)行檢索,蛋白酶切類(lèi)型選擇胰蛋白酶,允許最大肽段漏切位點(diǎn)數(shù)為2。因BSA采用了高溫加熱的方式進(jìn)行蛋白質(zhì)變性預(yù)處理,檢索時(shí)無(wú)固定修飾,蛋氨酸上的氧化(Oxidation, M)與蛋白質(zhì)N端的乙?；?Acetyl, proteinN-term)設(shè)置為可變修飾。允許的最小肽長(zhǎng)度設(shè)置為4。肽段水平假陽(yáng)性率(FDR)≤1%。

1.4.2細(xì)胞樣品

細(xì)胞樣品酶解后由EASY-nLC 1200與Thermo Orbitrap Fusion Tribrid質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行分離與鑒定。

色譜條件:色譜柱為實(shí)驗(yàn)室自主裝填的Nano-C18柱(15 cm×75 μm, 3 μm,填料來(lái)自德國(guó)Dr.Maisch公司);柱溫為25 ℃;流動(dòng)相A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為80%(v/v)乙腈水溶液(含0.1%(v/v)甲酸);流速為300 nL/min;梯度洗脫程序:0～50 min, 0%B～30%B; 50～53 min, 30%B～38%B; 53～54 min, 38%B～90%B; 54～60 min, 90%B。進(jìn)樣量:1 μL(肽段質(zhì)量約為200 ng)。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源,正離子模式;離子源電壓為2.3 kV;一級(jí)質(zhì)譜分辨率為120 000,一級(jí)質(zhì)譜的自動(dòng)增益控制(AGC)為5×105,最大離子注入時(shí)間為50 ms,全掃描范圍為m/z300～1 400;二級(jí)質(zhì)譜中母離子的選擇采用數(shù)據(jù)依賴模式;高能誘導(dǎo)裂解(HCD)的歸一化碰撞能量為28%,二級(jí)AGC為5×104,動(dòng)態(tài)質(zhì)量排除窗口為30 s。

數(shù)據(jù)檢索條件:由MaxQuant(1.5.4.1)軟件進(jìn)行檢索,蛋白酶切類(lèi)型選擇胰蛋白酶,允許最大肽段漏切位點(diǎn)數(shù)為2。半胱氨酸上的氨基甲酰甲基化(carbamidomethyl)為固定修飾,蛋氨酸上的氧化與蛋白質(zhì)N端的乙?；癁榭勺冃揎?。允許的最小肽長(zhǎng)度設(shè)置為7。肽段水平FDR≤1%。鑒定到的細(xì)胞蛋白數(shù)量為單次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化酶整體小柱的制備及表征

在制備有機(jī)聚合整體柱時(shí),因GMA在聚合后仍含有較活潑的環(huán)氧基而頗受青睞[23,29],但環(huán)氧基的化學(xué)改性需要在強(qiáng)堿性或高溫下進(jìn)行,條件比較嚴(yán)苛,于是本文選用了更活潑的PAS作為功能單體之一,其在常溫下即可與氨基等活性基團(tuán)反應(yīng),易于配體修飾。為了降低水解肽段的非特異性吸附[15],實(shí)驗(yàn)選用親水性的PETA作為交聯(lián)劑,同時(shí)在聚合溶液中加入功能單體HEMA增加整體材料的親水性。三元致孔劑DMSO、DMF、十二醇的使用可以得到良好的整體骨架與孔結(jié)構(gòu)。

圖1 固定化胰蛋白酶整體小柱的(a)制備流程圖和(b)掃描電鏡圖

本研究采用光聚合的方式制備整體小柱,聚合過(guò)程如圖1a所示:在紫外光照射下,光敏劑二苯甲酮從移液器吸頭的聚丙烯表面奪氫生成半頻哪醇自由基,并與吸頭內(nèi)表面的自由基結(jié)合形成穩(wěn)定的表面引發(fā)劑。在柱頭加入聚合液后,再次進(jìn)行紫外燈照射,表面引發(fā)劑被激活,釋放出自由基,實(shí)現(xiàn)功能單體與小柱內(nèi)表面的交聯(lián)接枝反應(yīng)。整個(gè)光聚合反應(yīng)僅需2 h便可完成。整體小柱切面的掃描電子顯微鏡(SEM)圖見(jiàn)圖1b?？梢钥闯?柱體材料與移液器吸頭內(nèi)表面結(jié)合緊密,無(wú)脫壁、塌陷等現(xiàn)象,通過(guò)觀察SEM放大圖,該材料具有較大的貫穿孔道,既保證了胰蛋白酶的穩(wěn)定固定化,又保證了良好的滲透性,使溶液在柱床中進(jìn)行對(duì)流傳質(zhì)。

2.2 胰蛋白酶固載量的測(cè)定

胰酶的固載量是影響酶解效率的關(guān)鍵因素[5]。在特定的限閾范圍內(nèi),胰酶的固載量越大,其局部濃度越大;與底物蛋白分子接觸的機(jī)會(huì)越大,則酶解效率越高[31]。實(shí)驗(yàn)用Pierce BCA試劑盒測(cè)定固定化前后緩沖溶液中胰蛋白酶的質(zhì)量,以確定整體小柱上胰酶的固載量。

圖2 不同(a)PAS質(zhì)量分?jǐn)?shù)和(b)柱床體積對(duì)胰蛋白酶固載量的影響

實(shí)驗(yàn)首先考察了PAS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)胰酶固載量的影響,在保持功能單體(12.4%)、交聯(lián)劑(12.6%)與致孔劑(75%)所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的情況下，調(diào)節(jié)功能單體 PAS與 HEMA的比例，制備了6款整體小柱。如圖2a所示,當(dāng)聚合溶液中活性酯PAS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1%增至5%時(shí),酶的固載量逐漸上升;活性酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%繼續(xù)增加至13%時(shí),酶的固載量略有降低。親水性的聚合材料可以降低水解肽段的非特異性吸附,在聚合溶液中加入HEMA可增加整體材料的親水性。實(shí)驗(yàn)最終確定功能單體PAS與HEMA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和7.4%,在確保胰酶最大固載量的同時(shí)減少了水解肽段的非特異性吸附。

隨后實(shí)驗(yàn)考察了整體小柱的柱床體積對(duì)酶固載量的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2b。隨著柱床體積增加,胰酶的固載量也逐漸增加。但當(dāng)柱床體積達(dá)到10 μL時(shí),整體小柱在酶固定化過(guò)程中出現(xiàn)了明顯的脫壁現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)最終選用7 μL的柱床體積,此時(shí)胰酶的固定量為108.8 μg。

圖3 CYC和BSA經(jīng)(a)溶液酶解10 min、(b)固定化胰蛋白酶整體小柱酶解10 min、(c)溶液酶解16 h后所得肽段的色譜圖

2.3 固定化酶整體小柱用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的高效酶解

在均相酶解過(guò)程中,傳質(zhì)速率是限制酶解動(dòng)力學(xué)過(guò)程的主要因素之一[31]。大多數(shù)常用的內(nèi)肽酶和外肽酶的米氏常數(shù)(Km)值都在5～50 mmol/L之間,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度低于μmol/L水平時(shí),酶解過(guò)程將受到顯著的阻礙[32]。為了避免這類(lèi)濃度極低卻又重要的痕量蛋白質(zhì)丟失,可以設(shè)法提高胰酶與蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度。在固定化酶整體小柱中,酶分子以共價(jià)鍵合的方式固定在柱體的貫通孔道內(nèi),相對(duì)于游離酶而言,其局部濃度得到了很大提升,當(dāng)樣品上樣后,待酶解蛋白質(zhì)與胰蛋白酶的相對(duì)濃度也進(jìn)一步增加[31]。同時(shí)離心帶來(lái)的驅(qū)動(dòng)力可以將所有流動(dòng)相強(qiáng)制通過(guò)多孔介質(zhì),達(dá)到最大的對(duì)流效果[33],酶解效果也隨之增強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)首先考察了不同酶解時(shí)間對(duì)固定化酶整體小柱酶解效率的影響。當(dāng)酶解時(shí)間為5 min時(shí),200 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液酶解并不完全;而將酶解時(shí)間增加至10 min時(shí),酶解效果良好;當(dāng)酶解時(shí)間為15 min時(shí),酶解效率與10 min條件下的效果相當(dāng)。因此選用10 min作為優(yōu)化后的酶解時(shí)間。

在優(yōu)化酶解時(shí)間后,分別取100 μL 200 ng/μL的CYC和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液于固定化酶整體小柱中酶解10 min。同時(shí),取相同濃度與體積的CYC和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液于37 ℃恒溫條件下分別溶液酶解10 min與16 h。不同酶解條件下得到的酶解液分別進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,所得色譜圖見(jiàn)圖3。對(duì)比圖3a與圖3b可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)酶解時(shí)間為10 min時(shí),固定化酶整體小柱的酶解效果明顯優(yōu)于溶液酶解。CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)固定化酶整體小柱酶解可鑒定出17條肽段,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列覆蓋率為85%,溶液酶解10 min僅能鑒定到2條肽段,且在圖3a的22 min處可明顯觀察到CYC蛋白的信號(hào)峰。當(dāng)溶液酶解時(shí)間增至16 h時(shí)(見(jiàn)圖3c),酶解效率提升,可以鑒定到17條肽段。

將BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液恒溫溶液酶解10 min(見(jiàn)圖3a),僅可鑒定到4條肽段,序列覆蓋率僅為5.8%,但將BSA通過(guò)固定化酶酶解10 min(見(jiàn)圖3b)后可鑒定到37條肽段,氨基酸序列覆蓋度為43%,與16 h的溶液酶解(見(jiàn)圖3c)效果基本一致。但溶液酶解由于酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),容易發(fā)生肽段非特異性裂解,胰酶自酶解等現(xiàn)象[2],在色譜圖中產(chǎn)生信號(hào)干擾峰。而整體小柱的孔道可以穩(wěn)定胰蛋白酶,提供較高的局部酶濃度,在縮短酶解時(shí)間的同時(shí)有效避免了自酶解干擾。

圖4 不同條件下固定化胰蛋白酶整體小柱酶解CYC和BSA得到的肽段數(shù)量和序列覆蓋率

由于細(xì)胞中的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高動(dòng)態(tài)分布,許多蛋白質(zhì)在低豐度下自然表達(dá),這類(lèi)低濃度微量蛋白的酶解是蛋白組學(xué)研究中遇到的不利因素[34]。為了考察固定化酶整體小柱對(duì)微量蛋白質(zhì)的酶解效果,實(shí)驗(yàn)選擇了質(zhì)量濃度為1 ng/μL與10 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品,經(jīng)固定化酶整體小柱酶解后進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)CYC含量低至1 ng/μL時(shí),仍能鑒定到5條肽段,對(duì)應(yīng)的氨基酸序列覆蓋度為24%;當(dāng)含量提高至10 ng/μL時(shí),成功鑒定到12條肽段,對(duì)應(yīng)的序列覆蓋度為62%。說(shuō)明固定化酶整體小柱對(duì)低濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白仍具有較好的酶解效果。

2.4 固定化酶整體小柱穩(wěn)定性和重復(fù)性考察

本文還考察了固定化酶整體小柱的穩(wěn)定性。將固定化酶整體小柱于-20 ℃儲(chǔ)存1 d、1周、2周、3周、2個(gè)月和3個(gè)月后取出,恢復(fù)至室溫后用于CYC和BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的酶解(200 ng/μL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4a所示,即使儲(chǔ)存了3個(gè)月,該整體小柱仍維持著較高的酶解性能,在酶解產(chǎn)物中分別鑒定到了16條CYC肽段和34條BSA肽段,酶解效率較新鮮制備的整體小柱僅有輕微的降低,說(shuō)明固定化可以穩(wěn)定胰蛋白酶的性能。

為了考察固定化酶整體小柱的可重復(fù)使用性,實(shí)驗(yàn)選取了同一支固定化酶整體小柱先后酶解了20個(gè)200 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中,每?jī)蓚€(gè)相鄰樣品間均用50 mmol/L碳酸氫銨溶液清洗2次。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4b所示:同一支整體小柱即使重復(fù)使用了20次,酶解效率依然沒(méi)有降低,第20次實(shí)驗(yàn)中仍能鑒定到17條肽段,對(duì)應(yīng)氨基酸序列覆蓋率高達(dá)85%?？紤]到同一支固定化酶整體小柱重復(fù)處理不同樣品時(shí)可能會(huì)存在樣品殘留引起的記憶效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)取同一支整體小柱依次酶解5批200 ng/μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液,隨后采用這支整體小柱酶解3批200 ng/μL的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液(見(jiàn)圖4c)。在分析BSA時(shí),整體小柱維持了穩(wěn)定的酶解性能,5次酶解鑒定到的肽段數(shù)量相當(dāng),氨基酸序列覆蓋度為40%～46%;分析CYC時(shí),搜庫(kù)結(jié)果顯示沒(méi)有屬于BSA的肽段,重復(fù)使用的整體小柱對(duì)CYC仍有較高的酶解效率,對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列覆蓋率高達(dá)87%。以上結(jié)果說(shuō)明,固定化酶整體小柱對(duì)肽段的非特異性吸附較低,可重復(fù)用于酶解不同的蛋白質(zhì)樣品。

2.5 固定化酶整體小柱酶解NB4與Jurkat T細(xì)胞

為了考察固定化酶整體小柱對(duì)復(fù)雜樣品的酶解效率,本文選用了NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別收集1×105個(gè)NB4與Jurkat T細(xì)胞,超聲破碎、還原烷基化后分別導(dǎo)入整體小柱內(nèi),以2 000 r/min離心10 min后收集酶解液,經(jīng)脫鹽處理后進(jìn)行Nano-LC-MS/MS分析。作為對(duì)照,相同數(shù)量的細(xì)胞樣品經(jīng)相同條件處理后于37 ℃溶液酶解16 h,收集的酶解液經(jīng)脫鹽后由同一儀器相同參數(shù)下分析。

圖5 兩種方法酶解(a)NB4細(xì)胞和(b)Jurkat T細(xì)胞所得蛋白質(zhì)數(shù)量的文氏圖

圖5a顯示了NB4細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析結(jié)果,從文氏圖可以看出,兩種酶解方法共同鑒定到2 333個(gè)蛋白質(zhì),固定化酶整體小柱鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)為2 489個(gè),大于溶液酶解得到的蛋白質(zhì)數(shù)量(2 436個(gè)),提高了2.2%。對(duì)于Jurkat T細(xì)胞而言,整體小柱鑒定的蛋白質(zhì)總量為2 572個(gè),較溶液酶解鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量提高了6.1%。在胰蛋白酶的固定化過(guò)程中,偶爾會(huì)發(fā)生酶解活性位點(diǎn)被堵塞、胰酶三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲等現(xiàn)象[35],而對(duì)于這兩種細(xì)胞系而言,溶液酶解與固定化酶酶解兩種方式鑒定到的蛋白質(zhì)重疊部分占比較大,說(shuō)明了胰蛋白酶在固定過(guò)程中并未過(guò)多改變自身的構(gòu)象與活性,固定化后仍然維持著穩(wěn)定的酶解性能和高效的酶解效率。

以上分析結(jié)果體現(xiàn)了固定化酶整體小柱在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中應(yīng)用的可行性。復(fù)雜生物樣品在整體小柱中的酶解時(shí)間也僅需10 min,鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量?jī)?yōu)于溶液酶解方法。且離心式、平行化的酶解過(guò)程簡(jiǎn)化了樣品處理的流程,減少了樣品的損失與污染,同時(shí)增加了樣品處理的通量,十分適用于高通量蛋白組學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的研究。

3 結(jié)論

在基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,樣品制備是蛋白質(zhì)分析的關(guān)鍵步驟,而蛋白質(zhì)的酶解效率將影響整個(gè)樣品前處理的進(jìn)程。本研究以光聚合法在20 μL移液器吸頭原位聚合形成整體小柱用于微量蛋白質(zhì)的快速酶解。該固定化酶整體小柱使用4-戊烯酸琥珀酰亞胺酯為功能單體,無(wú)需化學(xué)修飾與其他偶聯(lián)試劑即可一步實(shí)現(xiàn)胰蛋白酶的固定化。同理,該固定化技術(shù)有望應(yīng)用于其他不同特性的酶。制備得到的整體小柱機(jī)械強(qiáng)度高,化學(xué)性能穩(wěn)定。在酶解過(guò)程中,樣品消耗量低,分析通量高,十分適用于微量的蛋白組學(xué)樣品分析。將固定化酶整體小柱應(yīng)用于酶解NB4細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞,酶解效果優(yōu)于常規(guī)的溶液酶解,在蛋白質(zhì)組學(xué)分析領(lǐng)域展現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。