石小康，丁佑銘，汪斌，余斌，徐雨

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 肝膽外科，湖北 武漢 430060）

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一，其中以肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）多見，約占70%～90%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在癌癥死因中，肝細(xì)胞癌是僅次于肺癌和胃癌的第三大死因，全球每年新增肝癌患者約841 000例患者，死亡病例高達(dá)782 000左右[2]。值得注意的是，僅中國就占每年新增病例和死亡人數(shù)的一半以上[3]。根治性治療術(shù)是目前治療肝癌的主要手段，通過嚴(yán)格的入選標(biāo)準(zhǔn)，部分患者甚至可以達(dá)到治愈的效果。盡管如此，由于大多數(shù)肝癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)間晚，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，故其預(yù)后仍然欠佳[4]。因此，亟需深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找敏感性高、特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，以期為肝癌的早期診斷、有效治療及預(yù)后判斷提供可靠依據(jù)。細(xì)胞周期是生命活動(dòng)的重要生物過程，腫瘤的形成與正常細(xì)胞周期失調(diào)息息相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白B1（CyclinB1，CCNB1）為G2/M期的起重要調(diào)控作用的細(xì)胞周期蛋白，是啟動(dòng)有絲分裂的關(guān)鍵分子。諸多研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如非小細(xì)胞肺癌[5]、乳腺癌[6]、胃癌[7]、結(jié)直腸癌[8]等。亦有研究發(fā)現(xiàn)該基因在肝癌組織呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝癌患者不良預(yù)后關(guān)系密切[9]。CCNB1是否可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文基于癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫肝癌組織標(biāo)本數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析CCNB1在肝癌中的表達(dá)并探究其異常表達(dá)的潛在機(jī)制；同時(shí)還分析了其異常表達(dá)在肝癌患者中的臨床意義，旨在闡明其在肝癌早期診斷及預(yù)后評(píng)估等方面的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與數(shù)據(jù)篩選

截至目前，TCGA數(shù)據(jù)庫收錄了來源于11 000多個(gè)腫瘤樣本的33種類型的癌癥數(shù)據(jù)資料?；诖?，本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載肝癌及正常肝組織樣本的mRNA seqV2表達(dá)譜數(shù)據(jù)集及匹配的患者臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理確診為肝細(xì)胞肝癌的肝癌患者；（2）有完整的臨床資料及預(yù)后隨訪資料；獲取的CCNB1基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Log2處理后用于后續(xù)分析。經(jīng)嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)篩選，最終余下正常肝組織樣本50例，肝癌組織樣本365例，其中有314例包含完整的無病生存時(shí)間隨訪。同時(shí)，從The Human Protein Atlas（HPA）數(shù)據(jù)庫（https://www.proteinatlas.org/）[10]下載CCNB1蛋白在肝癌組織（n=12）及正常組織（n=3）中的表達(dá)數(shù)據(jù)，旨在研究CCNB1在腫瘤組織及正常組織中蛋白水平的表達(dá)差異；此外，從UCSC xena網(wǎng)站（https://xena.ucsc.edu）[11]下載與之匹配的目的基因拷貝數(shù)變異及甲基化數(shù)據(jù)，旨在深入研究該基因表達(dá)上調(diào)的可能作用機(jī)制。

1.2 方法

1.2.1 患者分組：提取371例肝癌患者CCNB1 mRNA seqV2表達(dá)譜數(shù)據(jù)集及匹配的患者臨床病理資料，按照CCNB1表達(dá)水平，以中位數(shù)為截?cái)嘀?，小于中位?shù)的患者定義為CCNB1低表達(dá)組，反之則為高表達(dá)組。

1.2.2 富集分析：提取從cBioPortal數(shù)據(jù)庫下載的CCNB1共表達(dá)基因集[12]，篩選標(biāo)準(zhǔn)為：皮爾森系數(shù)≥0.8，共獲取95個(gè)共表達(dá)基因。然后，利用DAVID網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/）[13]進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）及KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，并利用Cytoscape軟件進(jìn)行富集結(jié)果比對(duì)。其中，GO分析結(jié)果包括三個(gè)部分，分別為細(xì)胞組分（cellular component，cc）、分子功能（molecular function，mf）、生物過程（biological process，bp）。

1.3 作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6軟件作圖，采用SPSS 22.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。癌組織與正常組織間基因表達(dá)水平及甲基化水平的差異表達(dá)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；CCNB1基因表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理學(xué)特征采用χ2檢驗(yàn)；受試者工作特征曲線（ROC）用于評(píng)價(jià)指標(biāo)診斷效能，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）；Kaplan-Meier法分別分析兩組患者的總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS），Log-Rank法檢驗(yàn)；單因素及多因素Cox回歸模型評(píng)價(jià)各臨床病理學(xué)參數(shù)及CCNB1表達(dá)水平對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響；線性回歸分析分析CCNB1表達(dá)與其DNA甲基化水平的相關(guān)性。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCNB1在肝癌組織及正常肝組織中的差異表達(dá)及診斷價(jià)值

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析CCNB1基因在肝癌組織和正常肝組織中的表達(dá)水平，同時(shí)提取TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌組織（n=371）和正常肝組織（n=50）中CCNB1 mRNA seqV2表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)果一致表明CCNB1在肝癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001） （圖1A和B）。為研究CCNB1 mRNA在肝癌組織和肝組織中的蛋白表達(dá)水平，我們利用HPA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CCNB1在正常肝組織（n=3）中無表達(dá)，肝癌組織（n=12）中有9例為中度表達(dá)，3例無表達(dá)（圖1D）。進(jìn)一步利用ROC模型對(duì)該基因表達(dá)情況分析，結(jié)果顯示ROC曲線下面積AUC=0.9799，95%CI0.9673～0.9924，提示CCNB1對(duì)肝癌具有良好的診斷效能（圖1C）。

2.2 CCNB1 mRNA表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的肝癌患者臨床病理資料，按照CCNB1 mRNA表達(dá)水平，以中位數(shù)為截?cái)嘀?，將肝癌患者分為高表達(dá)組（n=186）和低表達(dá)組（n=185），并分析高/低組患者臨床病理資料間的差異。結(jié)果顯示：兩組患者的種族（P=0.005）、AFP表達(dá)水平（P＜0.0001）、病理分級(jí)（P＜0.0001）、血管侵襲（P＜0.0001）等之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但比較兩組患者年齡（P=0.123）、性別（P=0.337）、TNM分期（P=0.057）、Child-Pugh肝功能（P=0.062）等發(fā)現(xiàn)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

2.3 CCNB1 mRNA表達(dá)與肝癌患者OS的關(guān)系

為了探究CCNB1 mRNA表達(dá)對(duì)肝癌患者生存預(yù)后的影響，利用Kaplan-Meier法進(jìn)行高/低表達(dá)組與肝癌患者OS的生存分析，結(jié)果顯示CCNB1 mRNA高表達(dá)患者與其不良OS顯著相關(guān)（P=0.0015） （圖2A）。為進(jìn)一步探究該基因表達(dá)對(duì)評(píng)估肝癌患者OS的預(yù)后價(jià)值，利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行了單因素和多因素分析。在單因素Cox回歸表明，CCNB1表達(dá)水平（P=0.001）、AFP表達(dá)水平（P=0.021）、TNM分期（P＜0.001）與肝癌患者OS顯著相關(guān)；在多因素Cox回歸分析進(jìn)一步提示TNM分期（HR2.088，95%CI1.421～3.066，P＜0.001）、CCNB1 mRNA表達(dá)水平（HR1.544，95%CI1.052～2.266，P=0.027）是影響肝癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

2.4 CCNB1 mRNA表達(dá)與肝癌患者DFS的關(guān)系

圖1A：CCNB1基因在多種腫瘤中的差異表達(dá)；B：CCNB1基因在肝癌組織（n=371）及正常肝組織（n=50）中表達(dá)比較；C：肝癌患者CCNB1基因表達(dá)的ROC曲線；D：CCNB1蛋白在正常肝組織（a）及肝癌組織（b）中的表達(dá)

表1 CCNB1表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

與此同時(shí)，利用Kaplan-Meier法進(jìn)行高/低表達(dá)組與肝癌患者DFS的生存分析，結(jié)果同樣表明，CCNB1 mRNA高表達(dá)患者與其不良DFS顯著相關(guān)（P=0.0004） （圖2B）。在單因素Cox回歸表明，CCNB1 mRNA表達(dá)水平（P＜0.001）、AFP表達(dá)水平（P=0.029）、TNM分期（P＜0.001）、血管侵襲（P＜0.001）與肝癌患者OS顯著相關(guān)；在多因素Cox回歸分析進(jìn)一步提示TNM分期（HR1.849，95%CI1.292～2.645，P=0.001）、CCNB1 mRNA表達(dá)水平（HR1.793，95%CI1.277～2.517，P=0.001）及血管侵襲（HR1.608，95%CI1.127～2.294，P=0.009）是影響肝癌患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（見表3）。

2.5 CCNB1 mRNA共表達(dá)基因集的GO分析和KEGG分析結(jié)果

為探討CCNB1基因參與肝癌形成的潛在機(jī)制，我們對(duì)CCNB1共表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，以預(yù)測CCNB1的基因功能。利用DAVID在線分析工具進(jìn)行富集分析，GO分析結(jié)果顯示，CCNB1共表達(dá)基因參與的生物過程（BP）包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、染色體分離、細(xì)胞分裂、DNA損失修復(fù)等；主要涉及的分子功能（MF）包括：染色質(zhì)結(jié)合、微管運(yùn)動(dòng)、蛋白質(zhì)結(jié)合等；主要涉及的細(xì)胞成分（CC）包括：細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、染色體及著絲粒區(qū)域等。KEGG分析結(jié)果顯示，CCNB1共表達(dá)基因主要參與細(xì)胞周期調(diào)控、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、p53信號(hào)通路等信號(hào)通路（圖3A）。同時(shí)利用Cytoscape軟件進(jìn)行KEGG富集分析，分析結(jié)果與上述基本一致（圖3B）。這提示，CCNB1可能通過細(xì)胞周期調(diào)控、介導(dǎo)DNA損失及影響p53信號(hào)通路等參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

圖2A：CCNB1高表達(dá)和低表達(dá)肝癌患者OS生存曲線；B：CCNB1高表達(dá)和低表達(dá)肝癌患者DFS生存曲線

表2 影響肝癌患者OS的臨床病理因素的單因素和多因素分析

表3 影響肝癌患者DFS的臨床病理因素的單因素和多因素分析

2.6 CCNB1 DNA甲基化與其基因表達(dá)的關(guān)系

圖3A：CCNB1共表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析；B：CCNB1共表達(dá)基因的通路富集分析

為深入探究該基因在肝癌中異常表達(dá)的潛在機(jī)制，我們利用UCSC xena網(wǎng)站進(jìn)一步對(duì)371例TCGA肝癌組織及50例正常肝組織標(biāo)本進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析。在所有肝癌組織標(biāo)本（n=371）中，共364例組織同時(shí)包含CCNB1拷貝數(shù)變異（copy number alterations，CNAs）和CCNB1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)（圖4A），其中，94例（25.8%）為復(fù)制子擴(kuò)增（+1/+2），223例（61.2%）例拷貝數(shù)無改變（0），按其拷貝數(shù)變異情況，分為擴(kuò)增組（+1/+2）和無改變組（0），進(jìn)一步分析兩組病人組織CCNB1基因表達(dá)差異，結(jié)果表明擴(kuò)增組患者CCNB1 mRNA表達(dá)明顯高于無改變組（圖4D），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。然后我們進(jìn)一步分析CCNB1 mRNA表達(dá)與其DNA甲基化水平的關(guān)系，結(jié)果表明CCNB1在肝癌組織中有12個(gè)甲基化位點(diǎn)（圖4B），且在肝癌組織中甲基化明顯低于正常肝組織（P＜0.001） （圖4C），CCNB1 mRNA與其平均甲基化水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.1327，P=0.011，圖4E）。這提示CCNB1異常表達(dá)可能部分受其基因甲基化水平的調(diào)控。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，占全世界癌癥死亡人數(shù)的9%，而在發(fā)展中國家則高達(dá)12%[1]。目前肝癌治療方式主要包括手術(shù)切除、肝移植、消融治療及肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（TACE）等，盡管治療手段多樣，但肝癌發(fā)病較為隱匿，大多數(shù)被診斷時(shí)已處于中晚期，因此其整體預(yù)后仍欠佳。鑒于臨床上肝癌發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)改善肝癌患者治療效果和提高患者生存率則尤為重要。眾所周知，AFP是原發(fā)性肝癌診斷中應(yīng)用最為廣泛的一個(gè)腫瘤標(biāo)記物，但其診斷敏感性和特異性并不高，分別為39%～64%和76%～91%[14]。因此仍需探尋新的分子靶標(biāo)，提高肝癌患者的早期診斷和預(yù)后判斷，以期更為積極有效地改善肝癌患者預(yù)后。CCNB1表達(dá)的蛋白cyclin B1是成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）的調(diào)節(jié)亞單位，其與MPF的催化亞單位細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）結(jié)合后，在G2/M期交接處發(fā)揮作用，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期時(shí)相轉(zhuǎn)換，是啟動(dòng)有絲分裂的關(guān)鍵分子。作為細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子，諸多研究發(fā)現(xiàn)CCNB1蛋白在多種腫瘤中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。Cooper等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)明顯上調(diào)，且高CCNB1表達(dá)患者總生存率明顯低于低表達(dá)組。同樣地，Begnami等[7]發(fā)現(xiàn)CCNB1在胃癌中表達(dá)明顯上調(diào)且與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。鑒于CCNB1在人類腫瘤中普遍表達(dá)上調(diào)且與大多數(shù)腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，筆者推測其可能成為潛在的癌癥檢測、治療及預(yù)后評(píng)估的重要靶標(biāo)。然而，關(guān)于CCNB1在肝癌組織及肝癌患者臨床預(yù)后研究目前尚少，因此本文利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了CCNB1在肝癌組織中的異常表達(dá)水平及其與肝癌患者臨床預(yù)后相關(guān)性，同時(shí)探究了其在肝癌組織中異常表達(dá)的潛在機(jī)制。

圖4A：CCNB1基因拷貝數(shù)變異與基因表達(dá)的關(guān)系；B：CCNB1基因表達(dá)與其DNA甲基化水平的關(guān)系；C：CCNB1在肝癌組織和正常肝組織甲基化水平比較；D：CCNB1表達(dá)在不同拷貝數(shù)變異組肝癌患者中的比較；E：CCNB1 DNA甲基化平均水平與CCNB1表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，其主要受到細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）、周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDKs）以及周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（CKIs）等的調(diào)控。它們之間相互調(diào)控以完成對(duì)細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控。既往文獻(xiàn)報(bào)道，Cyclins-CDKs-CKIs調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的相關(guān)蛋白或基因的改變與腫瘤的發(fā)生關(guān)系極為密切[15-17]。近年來，有學(xué)者認(rèn)為腫瘤實(shí)質(zhì)上就是一類細(xì)胞周期疾病，其發(fā)生、發(fā)展與正常細(xì)胞周期的失調(diào)控密切相關(guān)。因此，深入研究以細(xì)胞周期相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)的腫瘤治療有著廣闊的前景[18]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，無論是mRNA水平還是蛋白水平，CCNB1在肝癌組織表達(dá)均高于正常肝組織，且與肝癌患者不良OS和DFS明顯相關(guān)。分析CCNB1 mRNA與肝癌患者臨床病理特征間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CCNB1 mRNA表達(dá)水平與患者種族、AFP水平、病理分級(jí)、血管侵襲等顯著相關(guān)。Cox回歸分析表明CCNB1高表達(dá)是影響肝癌患者臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為進(jìn)一步深入探索CCNB1在肝癌中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，我們采用UCSC在線數(shù)據(jù)庫分析得出，其表達(dá)上調(diào)可能與CCNB1基因復(fù)制子擴(kuò)增有關(guān)，且CCNB1 DNA甲基化部分參與調(diào)控該基因的表達(dá)。

Yuan等[19]研究發(fā)現(xiàn)沉默CCNB1可以顯著降低乳腺癌細(xì)胞（MCF-7、MDA-MB-435及BT-474）的增殖能力同時(shí)提高細(xì)胞的凋亡率。為了研究CCNB1異常表達(dá)是否影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特征，張勇等[20]通過靶向CCNB1基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CCNB1基因敲除可以明顯增加肝癌細(xì)胞HepG2對(duì)化療藥物柔紅霉素的敏感性，CCNB1低表達(dá)的肝癌細(xì)胞克隆增殖能力顯著受到抑制，由此可知，HepG2的克隆增殖能力的確受到CCNB1高表達(dá)的影響。值得關(guān)注的是，通過抑制CCNB1表達(dá)不僅有效抑制肝癌細(xì)胞的能力增殖，還可增加其對(duì)化療藥物的敏感性。因此，探究CCNB1與肝癌的關(guān)系極具潛在的臨床價(jià)值。為了進(jìn)一步探究CCNB1在肝癌中的重要作用，我們利用GO和KEGG富集分析探究了CCNB1共表達(dá)基因的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，CCNB1共表達(dá)基因集主要參與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的功能如有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換、有絲分裂細(xì)胞周期的G2/M轉(zhuǎn)換、染色體分離、細(xì)胞分裂、DNA損失修復(fù)等，參與的調(diào)控通路包括細(xì)胞周期調(diào)控、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、p53信號(hào)通路等。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過CCNB1沉默可以誘導(dǎo)p53再活化和調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白，降低胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，減少肝癌細(xì)胞S期比例，相反顯著增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞的凋亡和衰老，提高了G0/G1期細(xì)胞比例。同樣，有文獻(xiàn)亦報(bào)道CCNB1的異常表達(dá)可通過p53信號(hào)通路等影響腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)[22-23]。有鑒于此，我們推測CCNB1亦可能通過上述機(jī)制參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展，但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以佐證。

本研究利用生物信息學(xué)方法分析了CCNB1在肝癌患者中的表達(dá)并探究其在肝癌組織中異常表達(dá)的潛在機(jī)制，同時(shí)分析了其異常表達(dá)在肝癌患者中的臨床意義，為進(jìn)一步研究CCNB1在肝癌中的基礎(chǔ)和臨床研究提供線索和依據(jù)，但仍需進(jìn)一步予以佐證?；诖?，本實(shí)驗(yàn)室將會(huì)進(jìn)一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平上驗(yàn)證CCNB1在肝癌中的具體作用機(jī)制，以期為肝癌的臨床診斷和治療提供新方向。