張茜，謝麗

1廣州市越秀區(qū)兒童醫(yī)院兒科(廣東廣州 510115)； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科(廣東廣州 510405)

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒常見(jiàn)的感染性下呼吸道疾病，而引起感染的原因多為呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV) 入侵所致。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，由RSV引起的呼吸道感染事件約占所有患病兒童的40%～50%，其在一年四季中均可發(fā)病，臨床表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、喘息，部分患兒甚至出現(xiàn)哮喘癥狀，往往對(duì)患兒的身心健康造成不利影響[1-3]。研究認(rèn)為毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，而白細(xì)胞介素-17(IL-17)、中性粒細(xì)胞在其中發(fā)揮重要作用，IL-17 是由 Th17 細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子[4-6]；而中性粒細(xì)胞是血液中數(shù)目最多的白細(xì)胞，當(dāng)發(fā)生局部感染或損傷時(shí)，它們可很快穿過(guò)血管壁進(jìn)入組織發(fā)揮作用，而且進(jìn)入組織后不再返回血液中，是反映細(xì)菌感染的一項(xiàng)重要指標(biāo)[7-8]。本研究旨在通過(guò)觀察RSV毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-17與中性粒細(xì)胞濃度，揭示其在發(fā)病過(guò)程中可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣州市越秀區(qū)兒童醫(yī)院住院部2016年3月至2017年3月期間住院的符合RSV毛細(xì)支氣管炎診斷患兒40例作為觀察組，其中男29例，女12例，患兒年齡60 d～16個(gè)月，平均(5.5±3.6)個(gè)月，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合文獻(xiàn)[5]。入院即查血RSV抗體陽(yáng)性的患兒入選，根據(jù)入院lowell評(píng)分≥10分為重度，<10分為輕度，分為重度組(10例)和輕度組(30例)患兒。毛細(xì)支氣管炎恢復(fù)期(簡(jiǎn)稱恢復(fù)期)，系毛細(xì)支氣管炎組患兒治療5～12 d后臨床癥狀緩解，無(wú)發(fā)熱、喘息，肺部聽(tīng)診無(wú)哮鳴音及濕性啰音。對(duì)照組：為同期住院的無(wú)喘息的病毒性肺炎患兒9例，其中男5例，女4例；年齡60 d～12個(gè)月，平均(5.1±3.1)個(gè)月。各組患兒的基線資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)以上各組要幼兒病程均在3 d以內(nèi)；(2)2周內(nèi)無(wú)類固醇激素應(yīng)用史、均無(wú)先天性心臟病史，慢性肺部疾病，既往無(wú)喘息史、家族史；(3)均簽署知情同意書者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良，或有其他感染性疾病者；(2)合并心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病或消化道出血等疾??；(3)不同意參加本實(shí)驗(yàn)者。

剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不能堅(jiān)持治療，不能配合觀察項(xiàng)目復(fù)查者；(2) 治療中出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，不適宜繼續(xù)接受試驗(yàn)者；(3)自行退出試驗(yàn)者。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本采集 觀察組、對(duì)照組患兒于入院當(dāng)天(未治療前)采集空腹靜脈血2 mL，高速離心分離血清，-80℃冷凍待測(cè)。

1.2.2 血清IL-17檢測(cè)方法 采用ELISA法測(cè)定血清IL-17，人IL-17 ELISA試劑盒由美國(guó)R&D公司提供，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 痰液收集處理 孩子經(jīng)鼻吸入特布他林(喘康速)后，用醫(yī)用口罩式超聲霧化器直接吸入3%生理鹽水，誘導(dǎo)時(shí)間為20～30 min。常規(guī)口腔護(hù)理后，打開(kāi)吸氣器，將吸氣壓力調(diào)節(jié)至50～100 mmHg，并將一次性導(dǎo)管連接到培養(yǎng)容器的吸管上。選擇6號(hào)二次吸管，阻斷負(fù)壓，插入吸氣管的口腔或鼻腔，并左右旋轉(zhuǎn)。吸痰并將痰吸入無(wú)菌培養(yǎng)容器中進(jìn)行檢查。在2 h內(nèi)處理痰液，并在測(cè)量合格質(zhì)液的體積后，加入4倍體積的0.1%二硫蘇糖醇(DTT)。在渦旋振蕩器內(nèi)接受15 s的振蕩，搖床搖動(dòng)15 min，加入等體積的磷酸鹽緩沖液并搖動(dòng)5 min。790 r/min，離心半徑12 cm，離心10 min，留下上清液進(jìn)行檢測(cè)，檢查可溶性物質(zhì)的濃度，通過(guò)細(xì)胞分選計(jì)數(shù)沉淀的細(xì)胞。細(xì)胞分選計(jì)數(shù)檢測(cè)直接在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)沉淀細(xì)胞用于分類，包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他有核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞)。

2 結(jié)果

2.1 各組間血清IL-17水平比較 輕度組與重度組血清IL-17水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但輕度組與重度組之間血清IL-17水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

項(xiàng)目例數(shù)IL-17輕度組3026.54±3.93?重度組1027.45±3.98?對(duì)照組921.95±3.32F值8.47P值0.0007

*與對(duì)照組比較P<0.05

2.2 各組呼吸道分泌物中各細(xì)胞濃度比較 輕度組、重度組與對(duì)照組3組間的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他有核細(xì)胞對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.60、5.78、14.08，P<0.05)，輕度組(恢復(fù)期)、重度組(恢復(fù)期)與對(duì)照組3組間中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他有核細(xì)胞對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.12、6.97、10.45，P<0.05)。重度組(恢復(fù)期)的中性粒細(xì)胞降低、淋巴細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但輕度組(恢復(fù)期)變化較小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

項(xiàng)目例數(shù)中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞其他有核細(xì)胞輕度組3034.45±18.9219.56±8.7445.73±22.21輕度組(恢復(fù)期)3027.63±13.4122.51±9.6850.16±18.75t值1.6111.2390.835P值0.1130.2200.407重度組1052.13±16.1511.95±6.1430.12±16.15重度組(恢復(fù)期)1034.95±15.2219.65±7.6044.53±12.58t值2.3222.3642.112P值0.0340.0310.051對(duì)照組911.63±7.529.85±5.2478.12±7.56

2.3 IL-17、中性粒細(xì)胞與RSV毛細(xì)支氣管炎之間的相關(guān)性 IL-17、中性粒細(xì)胞與RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)病呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 IL-17、中性粒細(xì)胞與RSV毛細(xì)支氣管炎之間的相關(guān)性

3 討論

毛細(xì)支氣管炎是一種嬰幼兒時(shí)期常見(jiàn)的與病毒感染相關(guān)的感染性疾病，RSV感染是最常見(jiàn)的病原體，占70%以上，喘憋伴呼氣性延長(zhǎng)和呼氣性喘鳴為其突出表現(xiàn)，并可導(dǎo)致肺氣腫和肺不張，缺氧嚴(yán)重時(shí)可合并急性呼吸衰竭、心力衰竭、腦水腫甚至出現(xiàn)窒息等而導(dǎo)致死亡，多在嬰幼兒時(shí)期發(fā)病，若未處理得當(dāng)將對(duì)患兒的身心健康造成不利影響[9-12]。研究認(rèn)為[8]，早診斷、早治療是改善毛細(xì)支氣管炎預(yù)后的關(guān)鍵所在。但目前對(duì)于該病的發(fā)病機(jī)制尚未出現(xiàn)確切說(shuō)法，但多數(shù)專家認(rèn)為其與患兒遺傳背景和環(huán)境因素密切相關(guān)，同時(shí)，它也與身體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)密切相關(guān)[13-16]。近年來(lái)隨著免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究的深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)到Th17在自身免疫疾病中的作用，Th17是存在于人體內(nèi)的一種的重要細(xì)胞，具有很強(qiáng)的促炎作用，代表不同于Th1/Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群，同時(shí)也具有一定的一類IL-23的依賴性，在分泌IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子中發(fā)揮重要作用[17-20]。此外，研究表明存在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和各種炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和各種細(xì)胞因子參與 RSV細(xì)支氣管炎的氣道炎癥過(guò)程[21]。但目前有關(guān)IL-10與中性粒細(xì)胞在RSV毛細(xì)支氣管炎研究報(bào)道較少，學(xué)術(shù)界關(guān)于其在疾病發(fā)作中的表達(dá)情況仍存在爭(zhēng)議。

本研究旨在探討IL-10和中性粒細(xì)胞在RSV細(xì)支氣管炎發(fā)病機(jī)制中的作用，為不同類型毛細(xì)支氣管炎患兒的治療和預(yù)后提供依據(jù)。通過(guò)調(diào)查40例RSV毛細(xì)支氣管炎確診患兒與9例病毒性肺炎患兒的臨床資料與相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果顯示：輕度組與重度組血清IL-17水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但輕度組與重度組之間血清IL-17水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明IL-17可能參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制，而Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17。關(guān)于 IL-17，目前已有研究證實(shí)IL-17在潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病呈現(xiàn)高表達(dá)[22-23]。學(xué)者認(rèn)為其是一種主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化，并刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中各種細(xì)胞因子和化學(xué)刺激激素和細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致發(fā)生炎癥反應(yīng)；它也是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)子，其通過(guò)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放來(lái)擴(kuò)增炎癥反應(yīng)[24]。由表2可知，輕度組、重度組與對(duì)照組3組間的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他有核細(xì)胞對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，輕度組(恢復(fù)期)、重度組(恢復(fù)期)與對(duì)照組3組間中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及其他有核細(xì)胞對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，重度組(恢復(fù)期)的中性粒細(xì)胞降低、淋巴細(xì)胞升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)證明，中性粒細(xì)胞在病毒感染期間呼吸道癥狀發(fā)病中起重要作用，對(duì)預(yù)后有提示作用，這與學(xué)者的研究[25]結(jié)果一致。大量中性粒細(xì)胞聚集并活化以釋放炎癥介質(zhì)，如釋放氧自由基和蛋白水解酶(如去甲腎上腺素和髓過(guò)氧化物酶)來(lái)破壞病原體，能夠誘導(dǎo)明顯的炎癥反應(yīng)。此外，Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17可以有效地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞動(dòng)員的興奮過(guò)程，這也表明IL-17與中性粒細(xì)胞密切相關(guān)。IL-17參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化性，并協(xié)同刺激T細(xì)胞的活化。并能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟。因此，得以證實(shí)IL-17、中性粒細(xì)胞兩項(xiàng)指標(biāo)在RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)病中起到關(guān)鍵作用，同時(shí)IL-17、中性粒細(xì)胞之間也存在密切關(guān)聯(lián)，這有待開(kāi)展深入研究探討。

綜上所述，RSV毛細(xì)支氣管炎患兒的血漿IL-17和中性粒細(xì)胞水平顯著升高。通過(guò)測(cè)定血漿IL-17和中性粒細(xì)胞水平，可用于判斷疾病的發(fā)展趨勢(shì)，為判斷RSV細(xì)支氣管炎的免疫治療和預(yù)后提供分子依據(jù)，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。但本研究也存在一定不足之處，如追蹤時(shí)間有限,未追蹤到患者各種慢性并發(fā)癥的發(fā)展有明顯變化；受研究時(shí)間和條件的限制,本研究未進(jìn)一步延長(zhǎng)隨訪時(shí)間。下一步需要擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)追蹤時(shí)間，以期獲得更加準(zhǔn)確可靠的指標(biāo)判斷。