梁惠芬，曾鑫海，冼宇婷，陳慧霞，林梓琳，王潔如，張振霞，鄭玉忠

（韓山師范學(xué)院，廣東 潮州 521041）

余甘果（phyllanthusemblicaL.） 又名牛甘果、余甘子、油甘果、油柑等，為雙子葉植物綱、大戟科葉下珠屬植物[1,2]。余甘果喜光，主要分布在福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、貴州、云南等熱帶、亞熱帶地區(qū)[1-3]。同時(shí)余甘果適應(yīng)性強(qiáng)，并且耐干旱[4]，根系發(fā)達(dá)，有利于保持水土，有利于維護(hù)生態(tài)環(huán)境的正常。對(duì)余甘果的資源保護(hù)、開發(fā)、研究有著重要的意義。余甘果具有抗衰老[5]、抗壞血酸[6]、抗腫瘤[7]、降血壓[8]、降血脂等功效，潤肺化痰，生津止渴，增進(jìn)食欲，可治喉炎和乙肝肝炎[9]功效，能明顯治療和預(yù)防胃癌[1]。治療咽喉不適、煙酒過度、膽道蛔蟲絞痛等[4]，更是立竿見影。果肉含有豐富的維生素C[10]、E、B、Cu[11]等多種微量元素以及超氧化物歧化酶（SOD）[12,13]。其果果味先苦后甘，肉厚、纖維少、營養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高、效益好等特點(diǎn)。果實(shí)中含有多酚，生物堿，黃酮等多種生物活性物質(zhì)[14-16]。

目前，國內(nèi)對(duì)然已有對(duì)余甘果的加工的研究報(bào)告，但是對(duì)其脫澀工藝的優(yōu)化研究鮮有報(bào)道。余甘果中含有多酚，生物堿，黃酮等多種生物活性物質(zhì)，其中多酚含量最高，而多酚中以單寧為主要成分[17]。單寧是果實(shí)中澀味的重要代表物，脫澀程度越高，果實(shí)中的單寧含量越低。因此，本實(shí)驗(yàn)以新鮮余甘果為原料，采用分光光度法測(cè)定單寧提取率，并以單寧的提取率作為指標(biāo)，利用響應(yīng)面法對(duì)余甘果脫澀工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為新鮮余甘果，2019 年7 月中旬采購于廣東省潮州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，置于4℃冰箱短期冷藏。

實(shí)驗(yàn)試劑包括單寧酸、乙醇、丙三醇、鄰二氮菲、冰醋酸、乙二胺四乙酸二鈉、六合水三氯化鐵、無水乙酸鈉，均為分析純。

實(shí)驗(yàn)儀器：超聲波清洗儀（S22H，致微廈門有限公司）、電子天平（BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、恒溫水浴鍋（XMTD203，金壇市科析儀器有限公司）、臺(tái)式高效冷凍離心機(jī)（H1850R，湖南湘怡實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A 型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)T6新世紀(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、高速多功能打粉機(jī)（CS-700, 永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取單寧酸5mg，置于25 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解定容，作為0.1mg/mL 單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，分 別 取0μL、400μL、 800μL、 1200μL、1600μL、2000μL 單寧標(biāo)準(zhǔn)溶液于6 個(gè)25 mL 棕色容量瓶中，加入5 mL 蒸餾水和125μL 的0.1 mol/L FeCl3溶液，靜置20min，再加入5 mL 鄰二氮菲緩沖溶液 [m（0.015mol/L 鄰二氮菲）∶m（NaAc 緩沖溶液）∶m（0.05mol/L EDTA） =10∶5∶1]定容，靜置10min，在510nm 處測(cè)定各濃度的吸光度。以吸光度為縱軸，單寧濃度為橫軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得Y=0.2862X+0.0346，R2=0.9925。每次測(cè)定提取液獲得吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再換算成余甘果中單寧含量。

1.2.2 試樣制備

準(zhǔn)確稱量40 g 余甘果，烘干至恒重再稱量，得出干重比。稱取5.0 g 鮮果打碎，以m（水） ∶m（甘油） =9∶1 作為提取溶劑，提取時(shí)間為30 min，提取功率為100 W，多次提取，至溶液顏色清澈，合并濾液，抽取部分檢測(cè)，通過鄰二氮菲分光光度法[18,19]測(cè)定單寧含量。加入0.1mol/L FeCl3溶液與樣品液反應(yīng)，再加入鄰二氮菲溶液反應(yīng)，在510nm 處用分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)后的溶液進(jìn)行吸光度檢測(cè)，根據(jù)單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算余甘果中總單寧含量。

2 單因素試驗(yàn)

2.1 比較不同提取溶劑對(duì)單寧提取率的影響

將余甘果切半處理，以時(shí)間60 min、溫度為40℃、功率為100 W，料液比為1∶40（g/mL） 為提取條件，比較水、乙醇、水+甘油（4∶6）、乙醇+甘油（4∶6） 作為提取溶劑的提取效率。經(jīng)數(shù)據(jù)處理后，結(jié)果如圖1 所示。

五種提取溶劑提取率依次為：乙醇+甘油（13.91%）、水+甘油（11.83%）、乙醇（10.25%）、甘油（4.63%）、水（2.31%）。其中，乙醇+甘油的提取率最高，雖然比水+甘油的提取率高2.08%，但考慮環(huán)境和成本問題，選擇水+甘油作為單寧提取劑。通過分析數(shù)據(jù)，可得出，甘油的加入后，提取率明顯提高。

圖1 不同提取溶劑對(duì)單寧提取率的影響Fig.1 Effects of different extraction solvents on the yield of tannins.

2.2 水和甘油混合溶劑的配比對(duì)單寧提取率的影響

為優(yōu)選出水和甘油的最佳混合比例對(duì)單寧提取率的影響。準(zhǔn)確稱取余甘果14 g，中間切半處理，以時(shí)間為60 min，溫度為40℃、功率為100 W 作為提取條件，考察甘油與水混合比例分別為：2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4 對(duì)單寧提取率的影響，進(jìn)一步確定水和甘油的混合比例對(duì)單寧提取率的影響。結(jié)果如圖2 所示。分析數(shù)據(jù)后，確定m（甘油） ∶m（水） =4∶6 的單寧提取率最高。

圖2 不同混合比例對(duì)單寧提取率的影響Fig.2 Effects of different mixing ratios on the extraction yield of tannins.

2.3 料液比、溫度、時(shí)間對(duì)單寧提取率的影響

精確稱取14 g 新鮮余甘果，中間切半處理，提取溶劑為水+甘油，按下列提取條件提取，每次重復(fù)3 次試驗(yàn)。

1） 料液比（g/mL） 分別為20∶1、40∶1、60∶1，時(shí)間為60 min，溫度為40℃、功率為100 W；

2） 提 取 時(shí) 間 分 別 為60min、100min、140 min，料液比1∶40，溫度為40℃、功率為100 W；

3） 提取溫度分別為20℃、40℃、60℃，料液比1∶40，時(shí)間為60℃、功率為100 W。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為參考，把單寧提取率（%） 作為響應(yīng)值，選取料液比（g/mL）、提取時(shí)間（min）、提取溫度（℃） 3 個(gè)影響因素為自變量，采用三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化以上因素，水平及因素編碼如表1 所示。

表1 響應(yīng)面水平及因素編碼Tab.1 Response surface level and factor coding.

3 結(jié)果與分析

3.1 三因素的試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 提取溫度對(duì)單寧溶出率的影響

根據(jù)圖3 可知，單寧溶出率隨著提取溫度的增加而增大，60℃的提取溫度比40℃的提取溫度的單寧提取率略大。當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)單寧提取率最高。考慮單寧受熱易分解的特點(diǎn)，選擇提取溫度為20、40、60℃作為響應(yīng)面考察條件。

圖3 提取溫度對(duì)單寧溶出率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin dissolution rate

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)單寧溶出率的影響

根據(jù)圖4 可知，單寧溶出率隨著時(shí)間的增加先增大后減少。

圖4 提取時(shí)間對(duì)單寧溶出率的影響Fig.4 Effect of extraction time on tannin dissolution rate

當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到100 min 是單寧提取率最高。再增加提取時(shí)間，單寧提取率略有下降趨勢(shì)。時(shí)間過短，單寧類物質(zhì)不能完全溶出，單寧提取率低下。時(shí)間過長，可能導(dǎo)致其他一些雜質(zhì)成分溶出，損耗人力物力，并造成單寧提取率下降。根據(jù)以上結(jié)果分析，綜合考慮，選擇提取時(shí)間為60、100、140 min 作為響應(yīng)面考察條件。3.1.3 料液比對(duì)單寧溶出率的影響

根據(jù)圖5 可知，單寧溶出率隨著料液比的變化先增大后減少。

圖5 料液比對(duì)單寧溶出率的影響Fig.5 Effect of ratio of feed to liquid on tannin dissolution rate

在料液比為1∶40（g/mL） 時(shí)，單寧提取率達(dá)到最大。如果料液比太小，則單寧溶出不夠充分；而料液比太，單寧溶出率反而降低，可能由于樣品中溶出某些雜質(zhì)導(dǎo)致的。除此之外，提取溶劑用量過大不僅增加生產(chǎn)成本，后期相應(yīng)的提取處理工作的難度也會(huì)增加，從而降低單寧的提取率。綜合實(shí)際分析，選擇料液比為1∶20、1∶40、1∶60（g/mL） 作為響應(yīng)面水平。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化余甘果中單寧的提取工藝

以單因素試驗(yàn)結(jié)果作為參考依據(jù)，以單寧提取率作為響應(yīng)值，選取表2 中的三因素作為響應(yīng)面優(yōu)化因素，每次試驗(yàn)均重復(fù)3 次。應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，可得出單寧得率=16.66-0.71×A-1.26×B+0.69×C-0.96×A×B+1.21×A×C+0.070×B×C-1.98×A2-0.99×B2+1.16×C2，公式中：A 為提取溫度（℃），B 為料液比（g/mL），C 為提取時(shí)間（min）。

3.2.1 回歸方差數(shù)據(jù)結(jié)果

通過相關(guān)系數(shù)與方差分析結(jié)果來檢測(cè)回歸方程的準(zhǔn)確性和有效性，考察該數(shù)學(xué)模型是否可靠。由表3 可知P< 0.01，說明回歸模型達(dá)到顯著水平，失擬項(xiàng)P=0.1772>0.05，表現(xiàn)為“不顯著”，說明失擬項(xiàng)對(duì)于純誤差不顯著，表明該模型是合適的。變異系數(shù)CV (%) =7.05<10，說明試驗(yàn)可重復(fù)性較好。相關(guān)系數(shù)R2=0.8652，大于0.8，可知擬合程度很好，表明響應(yīng)值單寧提取率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，能較好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行分析。從表3 得出，料液比表現(xiàn)為對(duì)余甘果單寧提取率影響顯著，提取溫度的二次項(xiàng)表現(xiàn)為對(duì)余甘果單寧提取率影響極顯著，根據(jù)F 值的大小可得出各因素對(duì)余甘果單寧提取率影響的順序?yàn)椋禾崛×弦罕龋˙） ＞溫度（A） ＞提取時(shí)間（C）。

表2 余甘果單寧提取中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanaxdfficinalis

表3 回歸方程分析表Tab.3 Regression equation analysis table

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素相互影響分析

響應(yīng)面曲面坡度平滑時(shí)，表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響小。反之，當(dāng)響應(yīng)面曲面坡度陡峭時(shí)，則表明響應(yīng)值受變量交互作用的影響大。根據(jù)回歸模型，以提取溫度、提取時(shí)間、料液比中的兩個(gè)因素固定為零水平，就可以得出另外兩個(gè)因素的交互作用。模型的響應(yīng)面如圖6～圖8 所示。A（提取溫度） 與B（料液比） 之間的響應(yīng)面曲面坡度最陡，表明提取溫度與料液比的交互作用對(duì)余甘果單寧提取率的影響顯著。其次，A（提取溫度） 與C（提取時(shí)間） 響應(yīng)面曲面坡度較陡峭。C（提取時(shí)間） 與B（料液比） 響應(yīng)面曲面坡度較平滑，說明該兩種因素的交互作用對(duì)余甘果單寧提取率的影響不顯著。

圖6 提取時(shí)間與料液比兩因素之間的交互作用Fig.6 Interaction between extraction time and feed ratio

圖7 料液比與提取溫度兩因素之間的交互作用Fig. 7 Interaction between material ratio and extraction temperature

圖8 提取時(shí)間與提取溫度兩因素之間的交互作用Fig. 8 Interaction between extraction time and extraction temperature

3.2.2 最佳提取工藝的驗(yàn)證與確立

運(yùn)用響應(yīng)面分析結(jié)果，可以得到余甘果單寧提取工藝的最佳提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間為56.64℃，料液比為1∶22.47（g/mL），提取時(shí)間為110 min，超聲波功率為100 W 的條件下單寧提取率的理論值為19.04%。為了驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性、可靠性與實(shí)際操作的方便性，將實(shí)際提取工藝參數(shù)調(diào)整為提取時(shí)間為57℃，料液比為1∶23（g/mL），提取時(shí)間為110 min，超聲波功率為100 W。在此提取條件下，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得出實(shí)際單寧提取率平均值為14.83%，與理論值19.04%幾乎吻合，誤差在5%以內(nèi)，表明該回歸模型真實(shí)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論與分析

本試驗(yàn)嘗試將單寧提取的方法引用到脫澀工藝上，并且也得到了不錯(cuò)的效果。不僅能將澀味極重的單寧在簡(jiǎn)便的脫澀工藝下快速的果實(shí)中提取出來。經(jīng)文件檢索后，此前一般以余甘果粉末為試驗(yàn)原材料，無法保證果實(shí)完整性。本試驗(yàn)采用余甘果鮮果進(jìn)行單寧提取，能較大的保留著果實(shí)的完整性，減少其營養(yǎng)成分的流失。而在脫澀工藝上所運(yùn)用到的甘油是良好的單寧提取溶劑并且具有價(jià)格低廉、安全無毒等特性。此前，國內(nèi)使用甘油作為單寧的提取溶劑提取單寧的文章鮮有所見。

通過單因素試驗(yàn)，比較并確立最佳的提取溶劑為40%甘油。在確定最佳的提取溶劑基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、提取料液比進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示提取溫度為60℃、提取時(shí)間為100 min、提取料液比為1∶40 的提取效率較高。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用Design Expet8.06 設(shè)計(jì)響應(yīng)面并分析比對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、提取料液比3 個(gè)因素。經(jīng)過分析最終確定最佳的提取工藝為：40%的甘油為提取溶劑，提取時(shí)間為57℃，料液比為1∶23（g/mL），提取時(shí)間為110 min，得到余甘果單寧的提取率為14.83%，誤差在5%以內(nèi)。

單寧提取率稍微偏低，其一，由于采用不同月份余甘果果實(shí)進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，不同時(shí)期的果實(shí)成熟度不同，果實(shí)的軟硬程度對(duì)實(shí)驗(yàn)存在一定的影響。其二，響應(yīng)面提供的理論結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果本身存在一定的偏差。但總體偏差在誤差范圍內(nèi)，說明該回歸模型真實(shí)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可作為單寧提取的一種優(yōu)化方法。