朱克鵬 肖勛蓉 羅義 弋文 尹均明 楊川 杜果城

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，同時也是女性癌癥相關(guān)性死亡最主要的原因。微小RNA（microRNA，miRNA）-613 是近年來發(fā)現(xiàn)的miR?NA 家族重要成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌［1］、胃癌［2］、卵巢癌［3］及非小細胞肺癌［4］等多種惡性腫瘤中異常表達，可能與惡性腫瘤的發(fā)生進展相關(guān)，但在乳腺癌中miRNA-613 表達及作用機制尚不完全清楚。本研究旨在通過檢測乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達，進一步探討miRNA-613對乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響及可能的分子機制，為乳腺癌的靶向治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2017年5月至2018年5月91例于南充市中心醫(yī)院手術(shù)切除的乳腺癌患者的組織標本，癌旁組織距腫瘤邊緣5 cm 以上，組織離體后30 min 內(nèi)存儲于液氮中，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱待檢測?；颊呶葱蟹呕熂捌渌鼓[瘤治療，術(shù)后病理均經(jīng)病理學檢測確診。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準且得到受試者知情同意。

1.1.2 細胞與主要試劑 人高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231 和MDA-MB-468、低侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MCF-7 及人正常乳腺上皮細胞系HBL-100 均 購 自 美 國ATCC 公 司。TRIzol 及Lipo?fectamine 3000均購自美國Invitrogen公司，miRNA-613及U6 引物、miRNA-613 模擬物、模擬物陰性對照均購自上海吉瑪制藥公司；逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）試劑盒購自大連寶生物公司；CCK-8 試劑盒購自江蘇碧云天生物公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 公司；野生型、突變型雙熒光素酶報告質(zhì)粒pMIR-SOX9-WT、pMIR-SOX9-Mut 均購自廣州銳博生物公司；雙熒光素酶報告基因活性檢測試劑盒購自美國Promega 公司；SOX9、β-catenin、GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司；E-Cadherin和Vimentin抗體購自美國CST公司；HRP標記的二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測 qRT-PCR擴增條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。miRNA-613引物序列上游為5'-GTGAGT GCGTTTCCAAGTGT-3'，下游為5'-TGAGTGGCAAAG AAGGAACAT-3'；U6 引物序列上游為5'-GCGCGT CGTGAAGCGTTC-3'，下游為5'-GTGCAGGGTCCGAGG T-3'。以U6作為內(nèi)參，miRNA-613表達水平采用2-△△Ct法計算，△△Ct=［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］實驗組-［Ct（miRNA-613）-Ct（U6）］對照組。

1.2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫分析 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者的miRNA-613 表達和相對應(yīng)的生存資料，對miRNA-613 低表達組538 例和高表達組537 例進行生存分析。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后細胞分為miRNA-613模擬物組和陰性對照（NC）-模擬物組，轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，檢測轉(zhuǎn)染效率行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8實驗 收集對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染后每24 h加入10 μL/孔CCK-8溶液，繼續(xù)避光孵育2 h，酶標儀測定各孔450 nm波長處的吸光度值（A450nm）。

1.2.5 Transwell 侵襲及遷移實驗 Transwell 小室置于24孔板內(nèi)，小室內(nèi)膜均勻涂抹Matrigel膠凝固成膜行侵襲實驗，使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞制作細胞懸液，加入上室，同時在下室加入500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后取出小室，棉簽輕輕擦拭掉上室內(nèi)膜黏附的細胞，甲醛固定、染色，顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。Transwell 小室內(nèi)膜上不涂抹Matrigel膠，同樣操作行遷移實驗。

1.2.6 miRNA-613 靶基因SOX9 的預(yù)測 通過miR?NA在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan和miRanda，預(yù)測miRNA-613作用靶基因SOX9。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗 取MDA-MB-231接種于96孔板，將雙熒光素酶報告質(zhì)粒和miRNA-613模擬物（或NC-模擬物）共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細胞，分為miRNA-613模擬物+pMIR-SOX9-WT組、NC-模擬 物+pMIR-SOX9-WT 組、miRNA-613 模擬物+pMIR-SOX9-Mut 組、NC-模擬物+pMIR-SOX9-Mut組。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細胞，檢測熒光素酶活性。

1.2.8 Western blot 檢測 收集細胞樣品，提取細胞總蛋白，每組取等量蛋白樣品行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶里室溫封閉2 h后，加入一抗SOX9、β-catenin、E-Cadherin、Vimentin 和GAPDH 抗體，次日室溫孵育后再加入二抗。超敏ECL發(fā)光試劑進行顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗或單因素方差分析；計數(shù)資料采用n表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達

乳腺癌組織中miRNA-613的表達顯著低于癌旁組織（P＜0.05，圖1A），乳腺癌細胞系MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-468中miRNA-613的表達顯著低于正常乳腺上皮細胞系（P＜0.05），并且高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468 中miR?NA-613 的表達顯著低于低侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系MCF-7（P＜0.05，圖1B）。

圖1 乳腺癌組織和細胞中miRNA-613的表達

2.2 乳腺癌組織中miRNA-613 表達與患者臨床病理特征的相關(guān)性

以乳腺癌組織中miRNA-613表達水平的均值作為界值，分為低表達miRNA-613 組47 例和高表達miRNA-613 組44 例，分析顯示miRNA-613 表達與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、腫瘤最大直徑、組織學分級、ER、PR、HER-2狀態(tài)無顯著相關(guān)（P＞0.05，表1）。TCGA 數(shù)據(jù)庫分析顯示，miRNA-613 表達與乳腺癌患者的總生存率無關(guān)（P＞0.05，圖2）。

2.3 上調(diào)miRNA-613 表達對MDA-MB-231 細胞增殖活性的影響

miRNA-613模擬物組的miRNA-613表達明顯高于NC-模擬物組（P＜0.05，圖3A），miRNA-613模擬物組的A450nm值明顯低于NC-模擬物組（P＜0.05，圖3B）。

表1 miRNA-613表達與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

圖2 miRNA-613表達對乳腺癌患者總生存率的影響

2.4 上調(diào)miRNA-613 表達對MDA-MB-231 細胞侵襲和遷移能力的影響

miRNA-613模擬物組細胞侵襲和遷移細胞數(shù)目均明顯少于NC-模擬物組（P＜0.05，圖4）。

2.5 miRNA-613對靶基因SOX9的驗證

miRNA 在線靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan 和miRanda顯示miRNA-613存在能靶向結(jié)合SOX9的3'UTR，雙熒光素酶報告實驗檢測結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染miRNA-613模擬物進入MDA-MB-231 細胞后，可顯著降低野生型pMIR-SOX9-WT 的熒光素酶活性（P＜0.05），而不能抑制突變型pMIR-SOX9-Mut的熒光素酶活性（P＞0.05，圖5）。

2.6 上調(diào)miRNA-613 表達對SOX9、β-catenin、Vi?mentin和E-Cadherin蛋白表達的影響

miRNA-613 模擬物組細胞中的SOX9、β-catenin和Vimentin蛋白表達水平明顯低于NC-模擬物組（均P＜0.05，圖6），而E-Cadherin 蛋白表達水平明顯高于NC-模擬物組（P＜0.05，圖6B）。

圖3 CCK-8實驗檢測miRNA-613模擬物組上調(diào)miRNA-613表達對MDA-MB-231細胞增殖活性的影響

圖4 Transwell實驗檢測miRNA-613模擬物組上調(diào)miRNA-613表達對MDA-MB-231細胞侵襲和遷移能力的影響

圖5 miRNA-613靶基因的驗證

圖6 Western blot 檢測miRNA-613模擬物組細胞中的相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

研究證實，miRNA-613 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用［2-4］，但乳腺癌中miRNA-613的研究較少，并且作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-613在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中表達顯著降低，與已有研究結(jié)果一致［5-6］。本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-613 在高侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系中的表達顯著低于低侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系，并且miRNA-613表達與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著性相關(guān)，乳腺癌TNM 分期中的Ⅲ期患者組織中的miRNA-613表達明顯低于Ⅰ+Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中的miRNA-613表達明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，進一步提示miRNA-613 異常低表達可能與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移及進展有關(guān)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)乳腺癌細胞中miRNA-613 表達能明顯抑制腫瘤細胞的增殖活性、侵襲及遷移能力，同時Vi?mentin蛋白表達明顯下降，E-Cadherin蛋白表達明顯升高，提示miRNA-613 能通過調(diào)控EMT 影響乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究進一步通過生物信息學網(wǎng)站預(yù)測SOX9 可能是miRNA-613 下游靶向調(diào)控基因，并且在肝細胞癌［7］和膠質(zhì)瘤［8］中也發(fā)現(xiàn)miRNA-613 通過靶向調(diào)控SOX9 抑制腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移。Xue等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-613通過靶向調(diào)控SOX9 誘導胃癌細胞對順鉑的敏感性。本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實，miRNA-613 能與SOX9 的3'UTR 特異性結(jié)合，Western blot 證實miR?NA-613 能負性調(diào)控SOX9 蛋白表達，證明SOX9 為miRNA-613 的直接調(diào)控靶基因。SOX9 是SOX 家族的重要成員之一，研究顯示SOX9 在腫瘤中異常表達，與惡性腫瘤的發(fā)生、進展以及不良預(yù)后有關(guān)［10］。抑制乳腺癌細胞中的SOX9表達，能抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力及EMT 過程［11-12］。以上說明miRNA-613通過靶向調(diào)控SOX9表達影響EMT，從而抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號通路是影響腫瘤細胞EMT的重要分子通路。研究發(fā)現(xiàn)，SOX9能通過Wnt/β-catenin通路影響腫瘤細胞EMT，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)乳腺癌細胞中miRNA-613表達，能顯著抑制miRNA-613靶基因SOX9蛋白的表達，進一步降低Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵分子β-catenin蛋白表達，癌細胞增殖及侵襲遷移能力下降，EMT受到抑制。以上說明miRNA-613可通過調(diào)控SOX9、Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及EMT。

綜上所述，在乳腺癌組織和細胞中miRNA-613異常低表達，并且與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，miRNA-613可通過調(diào)控SOX9、Wnt/β-catenin信號通路抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及EMT，為乳腺癌的靶向治療提供新的研究方向。