姚曉峰 金銳 陶英杰 郭文宇

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部常見的第二大高發(fā)惡性腫瘤，約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%。OSCC是對于口腔中惡性腫瘤的統(tǒng)稱，包括舌、牙齦、唇、頰、口底、軟硬腭等部位發(fā)生的癌癥，具有侵襲性強(qiáng)、易早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點。AJUBA（ajuba LIM protein）基因位于人類染色體14q11.2［1］，蛋白結(jié)構(gòu)與LIM 家族的其他成員相似，通過LIM 或者preLIM 結(jié)構(gòu)與其他多種蛋白或DNA 結(jié)合，作為支架蛋白參與多種生物學(xué)過程，發(fā)揮多種生物學(xué)作用［2］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，AJUBA參與多種信號通路的調(diào)節(jié)。在惡性間皮瘤中，AJUBA 通過調(diào)控Hippo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制細(xì)胞增殖［3］。此外，AJUBA通過加強(qiáng)β-catenin 和GSK-3β 之間的結(jié)合促進(jìn)GSK-3β介導(dǎo)的β-catenin 磷酸化，從而對Wnt 信號通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)［4］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究鮮見報道，其在OSCC中的表達(dá)情況及對腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響仍有待探究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年2月至2015年12月天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院OSCC組織標(biāo)本共120例。其中男性75例，女性45 例；年齡≤60 歲54 例，＞60 歲66 例；T1+T2 期73例，T3+T4期47例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 石蠟包埋切片后，常規(guī)脫蠟，3%H2O2處理30 min，檸檬酸鈉抗原修復(fù)，一抗4℃過夜孵育，加入二抗孵育30 min 后，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水后中性樹膠封片，采集圖像并分析AJU?BA表達(dá)情況。根據(jù)陽性腫瘤細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)進(jìn)行陽性率評分，≤5%、5%～25%、25%～50%、≥50%分別計0～3 分；染色強(qiáng)度評分：無著色為0 分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3 分，兩項評分相乘所得分?jǐn)?shù)為最終評分。120 例OSCC 組織標(biāo)本按評分升序排列，低表達(dá)60例，高表達(dá)60例。

1.2.2 RNA 提取與qPCR 采用Trizol 法提取28 對OSCC 及癌旁組織總RNA，定量后吸取1 μg RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過SYBR Green mix 對cDNA 進(jìn)行qPCR 實驗，以GAPDH 作為內(nèi)參，檢測AJUBA及Snail的表達(dá)情況。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人OSCC細(xì)胞系Tca8113和TSCCA均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染 OSCC細(xì)胞接種于6孔板中，融合度達(dá)70%～80%時，利用Lipofectamine 3000將2.5 μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至Tca8113和TSCCA細(xì)胞中。AJUBA特異性siRNA及陰性對照購于吉瑪基因（蘇州）。當(dāng)6孔板中細(xì)胞融合度達(dá)40%時，采用RNAiMax轉(zhuǎn)染30 pmol si-AJUBA至Tca8113和TSCCA細(xì)胞中，48 h后進(jìn)行表達(dá)檢測或功能實驗研究。

1.2.5 MTT實驗 將OSCC細(xì)胞消化計數(shù)后，接種于96 孔板中（1×103個細(xì)胞/孔）。分別于第1、2、3、4、5天采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。具體步驟：100 μL培養(yǎng)基加入10 μL MTT 溶液，37℃孵育4 h 后吸去上清，加入150 μL DMSO 室溫孵育10 min，490 nm 波長檢測OD并分析。

1.2.6 Western blot 將OSCC 細(xì)胞用PBS 清洗2 遍，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心15 min，收集上清采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后，SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜完成后，5%脫脂牛奶封閉1 h，相應(yīng)一抗4℃過夜孵育。TBST 洗滌3 次后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光檢測蛋白的表達(dá)情況。

1.2.7 克隆形成實驗 Tca8113和TSCCA細(xì)胞接種于6孔板中（5×102個細(xì)胞/孔），培養(yǎng)14 d后，冰甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后，采集圖像并計數(shù)。

1.2.8 劃痕實驗 OSCC細(xì)胞消化后鋪于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度約100%時，使用10 μL 移液槍槍頭對孔中細(xì)胞劃痕，PBS清洗以去除脫落細(xì)胞。24 h后采集圖像，并采用Image J 圖像處理軟件對細(xì)胞遷移面積進(jìn)行分析。

1.2.9 Tranwell 實驗 OSCC 細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后加入已預(yù)鋪好Matrigel 的Transwell小室中，小室下方加入600 μL含20%胎牛血清的RP?MI 1640 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，用棉簽擦拭掉小室膜上方細(xì)胞，甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS清洗后采集圖像并分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，實驗數(shù)據(jù)通過3次獨立實驗獲得。兩組樣本間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AJUBA在OSCC組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

通過qPCR 檢測及TCGA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，AJU?BA 在OSCC 組織中的表達(dá)水平顯著升高（圖1A，1B）。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示OSCC組織中AJUBA表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（圖1C）。同時發(fā)現(xiàn)AJU?BA表達(dá)與OSCC的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，其表達(dá)越高，腫瘤分化越差（表1）。與AJUBA 低表達(dá)患者相比，AJUBA 高表達(dá)患者的預(yù)后相對較差（圖1D，P=0.019）。

表1 AJUBA表達(dá)與OSCC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.2 AJUBA對OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲

在Tca8113 和TSCCA 中敲降A(chǔ)JUBA 后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力受到顯著削弱（圖2A）。通過克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)JUBA 能夠抑制Tca8113和TSCCA 細(xì)胞的克隆形成（圖2B）。此外，與陰性對照組相比，si-AJUBA 組的劃痕面積較大，表明AJUBA 表達(dá)下調(diào)能夠?qū)е翺SCC 細(xì)胞的遷移能力降低（圖2C）。隨后進(jìn)行Transwell 實驗進(jìn)一步探究AJUBA 對OSCC 細(xì)胞侵襲的影響。結(jié)果顯示敲降A(chǔ)JUBA 后，Transwell 小室膜下方的腫瘤細(xì)胞數(shù)顯著減少，OSCC 細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制（圖2D）。

2.3 AJUBA對OSCC細(xì)胞Snail表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果表明，過表達(dá)AJUBA后，OSCC細(xì)胞中Snail表達(dá)升高，同時N-cadherin和Vimentin表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)下降。而敲減AJUBA導(dǎo)致Snail、N-cadherin和Vimentin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)上調(diào)（圖3）。以上結(jié)果表明AJUBA可能通過調(diào)控Snail影響OSCC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.4 OSCC中AJUBA與Snail的相關(guān)關(guān)系

通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，OSCC組織中的Snail mRNA水平顯著高于正常組織（圖4A，P=0.00 1）。Spearman相關(guān)性分析顯示AJUBA與Snail表達(dá)呈正相關(guān)（圖4B，P=0.001）。通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)Snail表達(dá)升高，提示OSCC患者預(yù)后不良（圖4C）。

圖1 AJUBA在OSCC中高表達(dá)及預(yù)后

圖2 AJUBA對OSCC細(xì)胞的增殖和侵襲

圖3 AJUBA對OSCC細(xì)胞Snail及下游蛋白表達(dá)的影響

圖4 Snail在OSCC中的表達(dá)及與AJUBA表達(dá)的相關(guān)關(guān)系

3 討論

研究表明AJUBA 能夠促進(jìn)多種腫瘤進(jìn)展，AJU?BA可與SP1形成復(fù)合體，誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌的增殖［5］。在食管鱗癌中，AJUBA能夠通過上調(diào)MMP10 和MMP13 的表達(dá)從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力［6］。然而也有證據(jù)顯示，AJUBA可以通過調(diào)控β-catenin 和YAP 通路，抑制肝癌細(xì)胞生長從而發(fā)揮抑癌基因的作用［7］。這可能與不同的細(xì)胞背景有關(guān)［8］。目前，AJUBA 在OSCC 中的研究較少，其發(fā)揮的功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍有待探究。本研究首先檢測AJUBA 在OSCC 中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AJUBA在OSCC中顯著高表達(dá)，并且提示不良預(yù)后。因此推斷AJUBA可能促進(jìn)OSCC進(jìn)展。

此外，免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示AJUBA 的表達(dá)與T 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，因此AJUBA 可能在OSCC 的增殖和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。通過功能實驗發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)JUBA 能夠顯著抑制OSCC 細(xì)胞的增殖和侵襲能力。這充分證實了AJUBA 在OSCC中發(fā)揮著促癌基因的作用，而AJUBA 調(diào)控的具體機(jī)制則需進(jìn)一步探究。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)表型或成纖維樣特性時出現(xiàn)的暫時、可逆的生物學(xué)過程［9］，解釋了腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟，在腫瘤研究中受到越來越多的關(guān)注［10］。EMT發(fā)生后，上皮細(xì)胞失去極性、細(xì)胞間連接降解、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重組、細(xì)胞形態(tài)改變，而這些改變使細(xì)胞獲得了更高的遷移、侵襲和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力［11］。因此，本研究進(jìn)一步檢測AJUBA對OS?CC 細(xì)胞EMT 的影響，發(fā)現(xiàn)敲減AJUBA 后，上皮樣標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)樣標(biāo)志物Vimentin及N-cadherin 表達(dá)下降，這表明AJUBA 能夠通過調(diào)控EMT發(fā)生而促進(jìn)OSCC的侵襲轉(zhuǎn)移。

大量研究表明Snail是調(diào)控EMT過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤中（如胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、OSCC 及惡性黑色素瘤等）均可轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達(dá)來促進(jìn)EMT 的發(fā)生［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)JUBA 能夠抑制Snail 的表達(dá)，同時在OSCC 中，兩者的表達(dá)呈正相關(guān)。因此本研究提示，AJUBA 通過影響Snail 表達(dá)從而下調(diào)E-cadherin 并促進(jìn)EMT 的發(fā)生。但AJUBA 與Snail 之間的具體調(diào)控機(jī)制仍值得深入發(fā)掘。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AJUBA 在OSCC 中高表達(dá)，且提示不良預(yù)后。AJUBA能夠調(diào)控Snail表達(dá)，從而影響OSCC的細(xì)胞增殖、侵襲及EMT發(fā)生。本研究初步揭示了AJUBA在OSCC中的功能及調(diào)控機(jī)制，為OSCC的臨床診療提供了理論依據(jù)和新的思路。