王 娟，劉青青，馮余寬

(1.四川省第四人民醫(yī)院婦科，四川 成都 610016；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，死亡率居?jì)D科腫瘤首位[1，2]。雌激素受體與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種女性惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)[3]。與乳腺癌不同，雌激素與卵巢癌的關(guān)系仍然存在爭議[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素及其受體在卵巢癌中的異常表達(dá)與卵巢癌患者的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后及對化療反應(yīng)有關(guān)，但其與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系始終存在爭議[5，6]。大規(guī)模的深度基因測序顯示，一些沒有蛋白編碼能力的長鏈RNA影響細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期，從而對腫瘤等疾病中有巨大的調(diào)控作用[7，8]。其中MALAT-1被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌，卵巢癌，結(jié)直腸癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。多項(xiàng)研究顯示MALAT-1能影響上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡[7]。而MALAT-1下游基因和雌激素調(diào)控通路靶基因有重疊[9，10]。本課題擬在以往病理檢測的研究外，利用細(xì)胞模型檢測雌激素及雌激素受體對卵巢癌的影響，并初步探討雌激素和MALAT-1的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2018年9月至2019年3月。人卵巢癌癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和OVCAR3購自ATCC細(xì)胞庫，胎牛血清購自BI公司，青鏈霉素購自Roche公司，強(qiáng)力霉素購自Sigma公司。長鏈聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自Roche公司，NheI和HindIII限制性酶購自Takara公司，RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑購自Qiagen公司。劃痕實(shí)驗(yàn)試劑盒購自Cell Biolabs公司。軟瓊脂購自Beckton Dickinson GmbH公司。細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自Promega公司。引物序列在成都擎科公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和OVCAR3在1640-F-12培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 lg/ml鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。細(xì)胞均購自ATCC細(xì)胞庫。在RPMI 1640中培養(yǎng)，添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 lg/ml鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.2.2雌激素受體表達(dá)載體的克隆和轉(zhuǎn)染 使用長鏈聚合酶鏈反應(yīng)(Expand Long Ranged NTPack，Roche Diagnostics)擴(kuò)增人雌激素受體的編碼序列(1788bp)。NheI限制性酶位點(diǎn)包含在PCR引物1(5’-GCCGGCTAGGCATGCCATGACCTCCACCA-3’)中，HindIII限制性酶位點(diǎn)包含在引物2(5’-CCTTAACCGACCGTGGAACCC-3’)中。反應(yīng)步驟如下：①預(yù)變性95 ℃、5 min；②35次循環(huán)：變性95 ℃、30 s，退火58 ℃、30 s，延伸72 ℃、3 min；③最終延伸72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，從凝膠中切出正確大小的條帶。用NheI和HindIII消化PCR產(chǎn)物，插入pcDNA3.1(Life Tech.)的克隆位點(diǎn)。

1.2.3短發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)與克隆 在DSIR(Designer of Small Interfering RNA)上設(shè)計(jì)了以人MALAT-1為靶點(diǎn)的短發(fā)夾pinRNA(shRNA)序列和作為陰性對照的亂序序列。并亞克隆到psilencer 4.1-cmv-neovector中。核苷酸序列如下：shRNA-F(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCT ATCTTCC -3’)；shRNA-R(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCTATCTTCC -3’)；陰性對照shScramble-F(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATACGGATCT -3’)；shScramble-R(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATA CGGATCT -3’)。將載體導(dǎo)入MB231細(xì)胞后，將新霉素(1 mg/ml，Sigma-Aldrich)加入培養(yǎng)基中，獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞克隆。

1.2.4定量mRNA分析 采用qiagen rneasy小型試劑盒提取總RNA。每個(gè)樣本總RNA的1 lg用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Life Tech)和隨機(jī)六聚體引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。人PSF基因的引物為：人(NR002819)Forward(5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG -3’)；Reverse(5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA -3’)。在Applied Biosystems 7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。利用熔融曲線分析了PCR產(chǎn)物的特異性。在進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)時(shí)，每個(gè)樣本都被復(fù)制。采用GAPDH作為內(nèi)部對照。

1.2.5劃痕試驗(yàn)(Cell Biolabs) 劃痕試驗(yàn)用于分析野生型A2780、E2處理的A2780和MALAT1敲除的細(xì)胞的遷移水平。根據(jù)制造商的說明，每孔加入2×105個(gè)細(xì)胞。移除插入物(0 h)后，采集傷痕區(qū)域的圖像。24小時(shí)后記錄傷痕閉合情況。采集圖像使用配備了數(shù)碼相機(jī)(Leica DFC300FX)的相差顯微鏡(Leica Microsystems)，并使用Adobe Photoshop CS3軟件對采集到的圖像進(jìn)行分析。

1.2.6軟瓊脂細(xì)胞集落成形試驗(yàn) 35 mm組織培養(yǎng)皿每個(gè)加入3 ml培養(yǎng)基(MEM；Invitrogen)和10%FBS、0.33%bd Difco瓊脂(Beckton Dickinson GmbH，海德堡，德國)分別制成軟瓊脂，再分別加入約5×103個(gè)野生型A2780、E2處理的A2780和MALAT1敲除的細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2以及高濕度條件下培養(yǎng)。21天后進(jìn)行細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。

1.2.7細(xì)胞增殖測定 平底6孔培養(yǎng)皿的每個(gè)孔加入含有10% FBS的MEM，并分別培養(yǎng)野生型MB231、E2處理的MB231和MALAT1敲除的細(xì)胞，環(huán)境為37 ℃、5% CO2。根據(jù)制造商的說明，將Celtiter 96(Promega Corporation，Madison，WI)添加到每個(gè)孔中。為了測定細(xì)胞活力，每24小時(shí)使用550 BioRad平板閱讀器(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)測量490 nm處的吸光度。每個(gè)樣品在分析中重復(fù)三次，并分別獨(dú)立重復(fù)兩次。100 lL DMEM用作空白對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高濃度雌激素(E2)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移為了檢測E2對卵巢癌細(xì)胞增殖和腫瘤克隆形成的影響，1 nM和100 nM濃度的E2分別被加入A2780和OVCAR3細(xì)胞系中，培養(yǎng)7天后，發(fā)現(xiàn)低濃度1 nM E2對細(xì)胞的增殖沒有影響，但當(dāng)E2濃度增加到100 nM后，兩種細(xì)胞的增殖都受到了抑制(圖1a)。隨后檢測了高濃度E2對其他常見女性腫瘤的影響，實(shí)驗(yàn)顯示高濃度E2對宮頸癌和肺癌細(xì)胞增殖沒有影響(圖1b)。隨后我們利用軟瓊脂克隆成形實(shí)驗(yàn)檢測高濃度E2對卵巢癌細(xì)胞克隆形成的影響，發(fā)現(xiàn)100 nM的E2能抑制腫瘤克隆形成 (圖1c)。劃痕實(shí)驗(yàn)被用來檢測高濃度E2對細(xì)胞遷移的影響，100 nM的E2處理A2780、OVCAR3細(xì)胞24 h后進(jìn)行劃痕，劃痕后24 h拍照觀察發(fā)現(xiàn)，未被E2處理的A2780細(xì)胞劃痕面積大大縮小，而E2處理的A2780細(xì)胞劃痕幾乎沒有變化(圖1d)。OVCAR3細(xì)胞劃痕面積有減少，但沒有A2780細(xì)胞明顯，未在圖中展示。

圖1 雌激素對卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的作用 a.A2780和OVCAR3細(xì)胞接受不同濃度雌激素處理后的生長曲線；b.宮頸癌細(xì)胞Hela和肺癌細(xì)胞A549細(xì)接100 nM濃度刺激處理后增殖變化；c.A2780和OVCAR3細(xì)胞接受100 nM濃度處理后單細(xì)胞克隆成形；d.A2780接受100 nM濃度處理后劃痕恢復(fù)情況。

2.2 雌激素以ERα依賴的方式下調(diào)MALAT-1抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移MALAT-1在卵巢癌中高表達(dá)，而MALAT-1下調(diào)抑制細(xì)胞遷移和侵襲[5，6]。Malat-1特異性的shRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)A2780細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與100 nM雌激素處理相似，A2780細(xì)胞的增殖下降(圖2a)，遷移也下降(圖2b)，熒光定量PCR的結(jié)果顯示，在雌激素處理后，A2780細(xì)胞中MALAT-1的表達(dá)水平降低(圖2c)。

雌激素有多個(gè)受體，為了找出雌激素對MALAT-1的調(diào)控方式，ERα和ERβ特異性的shRNA被分別轉(zhuǎn)染入A2780細(xì)胞，并用強(qiáng)力霉素篩選獲得穩(wěn)定缺失ERα雌激素受體表達(dá)的A2780-αKD細(xì)胞和穩(wěn)定缺失ERβ雌激素受體表達(dá)的A2780-βKD細(xì)胞(圖2D)。對2780，A2780-αKD 和A2780-βKD細(xì)胞用100 nM雌激素處理24 h后檢測MALAT-1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有A2780-βKD細(xì)胞中其表達(dá)水平未受影響(圖2E)。

2.3 雌激素在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MALAT-1的表達(dá)為了探索雌激素調(diào)控MALAT-1的可能的機(jī)制，100 ng/ml的放線菌素D和E2被分別加入A2780細(xì)胞，24 h后檢測MALAT-1 RNA水平，發(fā)現(xiàn)MALAT-1的表達(dá)都下調(diào)了(圖3a)，推測雌激素是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控MALAT-1，因?yàn)镸ALAT-1的半衰期沒有縮短。為檢測雌激素對MALAT-1的調(diào)控是否是可逆，在雌激素處理24 h后，更換培養(yǎng)基，檢測RNA水平發(fā)現(xiàn)恢復(fù)到處理前(圖3b)，劃痕實(shí)驗(yàn)也顯示，在去除雌激素后，A2780細(xì)胞的遷移能力也恢復(fù)了(圖3c)。綜上所述，雌激素在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MALAT-1表達(dá)，其對MALAT-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是可逆的。

3 討論

過去四十年，應(yīng)用激素治療上皮卵巢癌并無重大進(jìn)展，各種研究結(jié)論不盡相同[11，12]，直到最近，通過確定與預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物對上皮性卵巢癌激素治療的人群進(jìn)行研究，才為雌激素替代治療提供了新的依據(jù)，將雌激素受體作為治療靶點(diǎn)[5，13，14]，因此雌激素替代治療對卵巢癌的治療十分重要[4]。盡管雌激素受體的陽性表達(dá)率在上皮性卵巢癌中占到了67%[15]，但是針對雌激素的治療目前取得的進(jìn)展很少，雌激素及其受體的治療效果和治療價(jià)值也沒有系統(tǒng)性研究[4]。此外，由于研究的樣本量較小，卵巢癌病理類型的不同，卵巢癌細(xì)胞激素受體表達(dá)情況的復(fù)雜性和評估效果的生物標(biāo)志物的不統(tǒng)一，目前并無一致的定論[11]。因此，本課題從細(xì)胞模型入手，發(fā)現(xiàn)雌激素對卵巢癌細(xì)胞具有劑量效應(yīng)，在低劑量下，不能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，在高劑量下，能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移。這種劑量效應(yīng)提示了在雌激素替代治療中，要加強(qiáng)對患者體內(nèi)雌激素表達(dá)水平的檢測，及時(shí)根據(jù)患者體內(nèi)雌激素表達(dá)的水平調(diào)整雌激素補(bǔ)給量。

圖2 雌激素通過雌激素受體ERα下調(diào)MALAT-1 a.A2780細(xì)胞下調(diào)MALAT-1后細(xì)胞增殖曲線，其中Scramble為非特異性shRNA，和PBS均為陰性對照；b.A2780細(xì)胞下調(diào)MALAT-1后劃痕恢復(fù)情況；c.100 nM雌激素處理A2780 24 h后MALAT-1的表達(dá)水平，其中18 s rRNA為不相干對照；d.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中檢測ERα和ERβ的表達(dá)水平；e.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中檢測MALAT-1的表達(dá)水平。

圖3 雌激素可逆性的調(diào)控MALAT-1的轉(zhuǎn)錄 a.放線菌素D(ACD)處理后，MALAT-1的表達(dá)水平；b.雌激素去除后MALAT-1的表達(dá)水平；c.雌激素去除后，A2780細(xì)胞的劃痕恢復(fù)情況

目前的研究顯示MALAT-1在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其下游基因涉及細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和侵襲、能量代謝、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖多個(gè)不同的層次[8]，但目前對MALAT-1的上游調(diào)控元件的研究幾乎沒有。MALAT-1在腫瘤進(jìn)程中上調(diào)的機(jī)制目前還不清楚，對影響MALAT-1上調(diào)的因素目前也沒什么相關(guān)報(bào)道。本課題的研究結(jié)果提示高濃度17β通過ERα下調(diào)MALAT-1，ERα是MALAT-1上游調(diào)控元件之一，為卵巢癌及其他受MALAT-1上調(diào)而發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤提供了新的治療靶位點(diǎn)和新的干預(yù)手段。

此外，這種作用是依賴雌激素受體ERα的，提示ERα可作為一個(gè)潛在的指標(biāo)用于檢測卵巢癌的預(yù)后和復(fù)發(fā)。其中，當(dāng)ERβ受體被敲除后，雌激素處理使得MALAT-1的下調(diào)更多，可能是雌激素受體間存在競爭性關(guān)系，當(dāng)ERβ被敲除后，ERα受體發(fā)揮的調(diào)控作用獲得加強(qiáng)，MALAT-1的轉(zhuǎn)錄被抑制得更多。總之，在后續(xù)的研究中，我們將收集卵巢癌樣本，對卵巢癌進(jìn)行更仔細(xì)的病理劃分，探索ERα作為卵巢癌預(yù)后的生物標(biāo)志物的可行性。