明 利，辜剛鳳，紅 艷，雷蕊綺，蔣 力，李經(jīng)倫

(1.成都天府新區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610213；2.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

一氧化碳(CO)中毒是最為常見(jiàn)的致命性空氣中毒，因其神經(jīng)損害嚴(yán)重，臨床癥狀多且復(fù)雜，治療及預(yù)后不佳，造成了一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題[1]。部分患者在發(fā)生CO中毒癥狀恢復(fù)后經(jīng)過(guò)約2周左右的無(wú)癥狀期后，可出一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征，主要為表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知功能、內(nèi)臟自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等，稱(chēng)為急性CO中毒遲發(fā)性腦病(DEACMP)[2]。雌激素是人體內(nèi)常見(jiàn)甾體類(lèi)固醇激素，具有抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、改善線(xiàn)粒體功能、協(xié)調(diào)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)等功能[3]。在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有一定的保護(hù)作用。胡慧軍等在CO中毒遲發(fā)型腦病臨床實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在相同的中毒環(huán)境下，絕經(jīng)前女性中毒程度更輕、預(yù)后更好，并首次提出女性生殖激素可能在CO中毒后的腦損傷中具有保護(hù)作用[4]。髓鞘堿性蛋白(MBP)及髓過(guò)氧化物酶(MPO)與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，可作為炎癥、應(yīng)激指標(biāo)評(píng)估神經(jīng)系統(tǒng)損傷的程度。本文探討雌激素在CO中毒遲發(fā)性腦病中的作用，在實(shí)驗(yàn)中建立了DEACMP大鼠模型，測(cè)定雌激素在DEACMP中對(duì)大鼠血清 MBP、MPO的表達(dá)影響，為雌激素在CO中毒遲發(fā)型腦病的臨床治療中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組2017年10月，西南醫(yī)科大學(xué)選用雄性SD鼠(250-300 g)72只隨機(jī)分為空氣組、CO組和雌激素組，每組各設(shè)置3個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠。大鼠由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)在恒溫干凈的房間，溫度(22±2) ℃，設(shè)置為12 h光暗周期。

1.2 急性CO中毒大鼠模型的制作及檢測(cè)將實(shí)驗(yàn)大鼠按首劑100 ml/kg腹腔注射CO氣體，后分別間隔4、8、12小時(shí)追加注射首劑的一半。隨后隨機(jī)抽取每個(gè)亞組大鼠1只，分別于染毒前及首次染毒后15 min及每隔兩小時(shí)至20 h時(shí)分別取鼠尾靜脈血0.5 ml血?dú)夥治鰷y(cè)定HbCO濃度。于造模結(jié)束后，雌激素組大鼠每天9：00-10：00時(shí)皮下注射溶有10 μg 17β一雌二醇的0.1 ml大豆油。CO組空氣組和對(duì)照組皮下注射0.1 ml大豆油，直至處死。

1.3 Morris水迷宮將水迷宮放在避光避聲的房間，水溫保持在(20±1) ℃。大鼠每天訓(xùn)練2次，設(shè)定最長(zhǎng)游動(dòng)時(shí)限為120秒，以記錄大鼠找到平臺(tái)時(shí)間稱(chēng)逃避潛伏期?？紤]大鼠中毒后短時(shí)間內(nèi)不能進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，我們的水迷宮實(shí)驗(yàn)選擇造模前及從第3天開(kāi)始進(jìn)行，因嚴(yán)重急性CO中毒會(huì)導(dǎo)致大鼠無(wú)法進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)的大鼠將被淘汰。訓(xùn)練6天，第7天正式進(jìn)行定位導(dǎo)航和空間探索，造模前淘汰有認(rèn)知功能障礙大鼠，造模后篩查出發(fā)生遲發(fā)型腦病大鼠并做標(biāo)記。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在大鼠染毒后2小時(shí)、7天、14天、21天各亞組大鼠鼠尾靜脈取血5 ml進(jìn)行MBP和MPO血清濃度測(cè)定。

1.5 標(biāo)本制作各亞組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，使用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射將大鼠深度麻醉迅速進(jìn)行心臟灌洗固定后取腦行HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析及LSD-t檢驗(yàn)；穿越平臺(tái)次數(shù)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物中毒改變行為學(xué)大鼠腹腔注射CO后出現(xiàn)輕度活躍，煩躁，呼吸急促，部分大鼠出現(xiàn)明顯躁狂、角弓反張。再次追加CO時(shí)大鼠表現(xiàn)為四肢癱軟、口唇黏膜發(fā)紺及肢體末端出現(xiàn)明顯櫻桃紅色，甚至出現(xiàn)昏迷及死亡(圖1，圖2)。整個(gè)染毒過(guò)程，CO組大鼠死亡11只，雌激素組死亡4只，空氣組大鼠全部存活，死亡大鼠及時(shí)用備用大鼠補(bǔ)充。CO組大鼠16小時(shí)內(nèi)檢測(cè)其COHb濃度為(54.09±3.67)%，而空氣組COHb濃度為(0.65±0.28)%。

圖1 大鼠CO中毒后出現(xiàn)昏迷

圖2 大鼠CO中毒后口唇粘膜出現(xiàn)櫻桃紅色

2.2 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果在水迷宮試驗(yàn)中，CO組大鼠逃避潛伏期在第3～21天均大于空氣組(P<0.05)；CO組與雌激素組大鼠分別在14天和7天相比逃避潛伏期明顯延遲(P<0.05)，空氣組在各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期無(wú)明顯延遲(P> 0.05)，見(jiàn)表1。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，CO組較空氣組及雌激素組在第14天時(shí)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 HE染色結(jié)果空氣組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；CO中毒組海馬組織神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、破碎，染色質(zhì)碎裂，胞質(zhì)和胞核界限不清；雌激素處理組在各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元細(xì)胞壞死和CO中毒組相比一定程度上減輕。見(jiàn)圖1。

表1 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期比較 (s)

a與空氣組比較，P<0.05；b與雌激素組比較，P<0.05；c與造模前及3d、7d比較，P<0.05

圖1 各組海馬組織在14天HE染色(×400倍) a：空氣組海馬CA1正常細(xì)胞；b：CO組海馬CA1細(xì)胞壞死明顯；c：雌激素海馬CA1細(xì)胞。

2.4 酶聯(lián)免疫法空氣組大鼠血清MBP、MPO濃度無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。CO組MBP水平明顯高于空氣組和雌激素組(P<0.05)(表2)。CO組在第14天MPO濃度水平較空氣組及雌激素組也明顯增加(表3)。

表2 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MBP水平 (μg/L)

a與空氣組及雌激素組比較，P<0.05

表3 三組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MPO水平 (μg/L)

a與空氣組及雌激素組比較，p<0.05

3 討論

目前DEACMP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，很多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與炎癥反應(yīng)、免疫損傷、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、腦白質(zhì)脫髓鞘等可能存在關(guān)系[5，6]。既往研究證實(shí)海馬發(fā)揮著認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等重要功能，其損傷和多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CO中毒后大鼠海馬組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理?yè)p傷，主要表現(xiàn)為出現(xiàn)大量變性和壞死的神經(jīng)元，在中毒第14天時(shí)達(dá)到高峰。Morris水迷宮主要檢測(cè)大鼠的空間記憶能力，主要涉及海馬相關(guān)腦區(qū)，在本實(shí)驗(yàn)水迷宮實(shí)驗(yàn)中結(jié)果中大鼠在CO中毒后的14～21天，逃避潛伏期出現(xiàn)明顯延遲，空間探索中經(jīng)過(guò)目標(biāo)象限的次數(shù)也明顯減少，說(shuō)明大鼠在第14～21天發(fā)生了遲發(fā)型腦病導(dǎo)致的記憶認(rèn)知功能損傷。因此我們通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)和海馬組織學(xué)分析篩選出在急性CO中毒后出現(xiàn)了遲發(fā)型腦病的大鼠用于實(shí)驗(yàn)研究是有效的。

美國(guó)學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)CO中毒后，腦內(nèi)自由基生成增加可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致腦內(nèi)MBP的改變[8]。MBP作為髓鞘中抗原活性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，位于髓鞘漿膜面，能夠維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[9]。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭受損傷時(shí)，髓鞘受到破壞，血腦屏障及通透性改變，可造成MBP在血清中濃度增高[10]。研究表明，MBP在腦損傷、脫髓鞘疾病、缺血性腦血管病、神經(jīng)退行性疾病及慢性神經(jīng)性疼痛疾病中廣泛存在，可作為神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性損傷標(biāo)志物[11，12]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，急性CO中毒后血清MBP明顯增加，說(shuō)明在CO中毒后大鼠存在脫髓鞘改變，發(fā)生了MBP的降解，導(dǎo)致血清MBP濃度的增加，進(jìn)一步證明MBP可能參與了急性CO中毒后遲發(fā)性腦病的發(fā)病過(guò)程。而MPO作為一種獨(dú)立于其他炎癥因子的一種新的炎癥因子，與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是炎癥和氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[13]。MPO能通過(guò)氧化作用產(chǎn)生的自由基，造成與神經(jīng)元損傷，因其水平與中性粒細(xì)胞的活化密切相關(guān)，可作為中性粒細(xì)胞功能和活化的標(biāo)志[14]。本研究表明急性CO中毒后可能出現(xiàn)逐漸加重的炎癥反應(yīng)，MPO增高可能激活中性粒細(xì)胞并引發(fā)炎性反應(yīng)，限制紅細(xì)胞中的氧轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致組織缺氧，進(jìn)一步出現(xiàn)遲發(fā)型腦病。

近年來(lái)很多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素在腦外傷、卒中、神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[15]。其能透過(guò)血腦屏障，聚集在腦組織的不同部位，如皮質(zhì)及海馬區(qū)、下丘腦等，與細(xì)胞內(nèi)受體結(jié)合，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗炎、加速病理性蛋白的清除起到神經(jīng)保護(hù)以及提高認(rèn)知的目的[16]。人體雌激素有三種類(lèi)型，17-β雌二醇(17-βestradio，17-βE2)、雌酮(Estrone)和代謝產(chǎn)物雌三醇(estriol)，其中17-β雌二醇生物效能最強(qiáng)。因此在我們實(shí)驗(yàn)中選擇17-βE2治療CO中毒大鼠，并評(píng)估其療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與CO中毒組相比，雌激素治療組大鼠在中毒后7天和14天的逃避潛伏期明顯縮短，在空間探索實(shí)驗(yàn)中，在第21天時(shí)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯增多。在HE染色結(jié)果中，雌激素治療組在各時(shí)間點(diǎn)海馬組織水腫和神經(jīng)元細(xì)胞壞死減輕，正常神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目增多。而在對(duì)血清MBP、MPO測(cè)定結(jié)果中顯示，雌激素治療組各時(shí)間點(diǎn)MBP水平明顯于低于CO組。與CO中毒組相比，雌激素組MPO水平在第14天也明顯減少。說(shuō)明大鼠發(fā)生急性CO中毒后，出現(xiàn)脫髓鞘改變、免疫炎癥反應(yīng)等，而雌激素雌激素可通過(guò)多種途徑改善代謝，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)損傷，有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和組織。

本實(shí)驗(yàn)中，CO中毒后，MBP及MPO的表達(dá)均明顯增加，而在使用雌激素治療后MBP及MPO的表達(dá)減少。雌激素可能通過(guò)抑制CO中毒大鼠后MBP、MPO的表達(dá)，阻斷中性粒細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的神經(jīng)損傷，減少細(xì)胞壞死，減輕脫髓鞘損傷，維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，一定程度上阻斷了遲發(fā)型腦病的發(fā)生，從而起到保護(hù)作用。但目前其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。