苗玉迪 李艷春 李慶瑞

急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)是1種源于造血干細胞癌變的疾病，具有治療困難，容易復發(fā)的特點，當前預后因素對AML根據(jù)進行分型以便于進行個性化治療，可分為低危、中危、高危三種，治療方法通常為先采取誘導化療使病情達到完全緩解后再行進一步化療或骨髓移植。AML的致病原因復雜至今尚未完全清楚，可能同遺傳學和環(huán)境因素的作用有關(guān)[1-3]。自噬是細胞清除問題蛋白質(zhì)和細胞器的過程，具體為用囊泡包裹細胞中問題蛋白或細胞器，然后與溶酶體融合成為自噬溶酶體，逐漸降解內(nèi)部物質(zhì)。自噬能產(chǎn)生細胞代謝所需的部分物質(zhì)[4]。自噬在不僅存在于機體正常生理過程中，在病患時期也可見，其對癌癥的發(fā)展所起的作用尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預后關(guān)系密切，大多數(shù)白血病細胞中自噬能力都會發(fā)生變化。研究表明自噬現(xiàn)象存在于白血病患者骨髓中，自噬缺陷可能可能是骨髓增生異常綜合征MDS向AML進展的發(fā)生機制[5-6]。自噬是由多種基因調(diào)控，自噬相關(guān)基因Beclin1是自噬形成過程中的可能1種重要的調(diào)控因子，在自噬的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。去泛素化酶UCH-L5是泛素蛋白酶UPS家族一員，研究顯示，其同某些腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，UPS是除了自噬以外的真核生物的另1種蛋白降解方式。微管相關(guān)蛋白LC3參與自噬體的形成，起定位于自噬泡和自噬泡膜表面[8]。 LC3是標記自噬體的特異性蛋白，其的表達強度與細胞自噬活性關(guān)系緊密。目前在急性髓系白血病中，自噬的發(fā)揮的作用及其機制尚不明確[9]。本研究擬通過分析AML患者的Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達情況，探究自噬同AML的關(guān)系，為診斷及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年2月至2018年2月在本院診斷和治療AML患者80例，劃分為AML初發(fā)組和緩解組，初發(fā)組40例，男性22例，女性18例，年齡18～73歲，平均年齡36.7歲；緩解組40例，男性21例，女性19例，年齡21～68歲，平均年齡39.45歲。另選取健康體檢患者40例，男性19例，女性21例，年齡24～70歲，平均年齡37.74歲。AML納入標準：經(jīng)臨床、血液學、骨髓細胞形態(tài)檢測，參照《血液病專斷及療效標準》確診為AML患者，骨髓形態(tài)學正常；排除標準：患有腫瘤、感染等嚴重疾病，處于妊娠或生理期女性，臨床病歷資料不全者。研究前向患者詳細介紹研究內(nèi)容，患者簽署知情同意書，研究獲得了本院倫理委員會的批準，三組患者年齡、性別等一般資料無統(tǒng)計學差異。

1.2 主要試劑及儀器

PBS液，淋巴細胞分裂液(上海博升生物科技有限公司)，自噬誘導劑雷帕霉素，自噬抑制劑3-MA，化療藥物阿糖胞苷，離心機(美國Sigma公司),ABI-Prism7500 實時熒光定量PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 測定各組基因表達 獲取健康組、初發(fā)組、緩解組患者脊髓液，抗凝保存。將HL-60細胞分為對照組，自噬誘導劑組、自噬抑制劑組、治療組，在IMDM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，各自加入100 nmol/l自噬誘導劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA、化療藥物阿糖胞苷，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。RT-PCR檢測以上各組Beclin1、UCH-L5、LC3的mRNA表達情況。

1.3.2 RT-PCR檢測方法 提取RNA。獲取各組患者骨髓液，并與-80 ℃存放備用。取骨髓液、HL-60細胞培養(yǎng)液各2 ml，經(jīng)抗凝，PBS液處理，加細胞分裂液，經(jīng)離心機作用分離單個核細胞，提取總RNA，于-80 ℃存儲。逆轉(zhuǎn)錄。①合成引物機探針。從GeneBank獲取ERG、MDR1、BAALC基因堿基序列，應用primer express 3.0設(shè)計引物及探針，各組基因以GAPD作為內(nèi)參，內(nèi)參基因探針及上下游引物:Beclin1上游為5'-GAAGACACAGGAGGCAGT-GG-3',下游為5'-AGGACACCCAAGCAAGACC-3'。UCH-L5上游5'-GGGTCTTCACCGAGiCTCATTA-3'UCH-L5下游5'-AAGTCGGGAGTCCTGAACCA-3'LC3上游5'-AAACGCATTTGCCATCACA-3'LC3下游5'-GGACCTTCAGCAGTTTACAGTCAG-3'。GAPDH上游5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'GAPDH下游5'-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。②構(gòu)建熒光定量PCR標準模板。③ 使用MJ 9700PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR反應測定表達值。使用ABI 7500全自動熒光定量PCR儀 (美國ABI公司)進行PCR反應，生成結(jié)果并分析計算。反應條件：94 ℃預變性5 min，隨后40個循環(huán)，94 ℃變性15 s,60 ℃延伸60 s，自動收集熒光，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、觀察、照相后獲取結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同危險度分級Beclin1、UCH-L5、LC3表達

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在 AML患者中增強，并隨危險度分級升高而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同危險度分層患者的Beclin1、UCH-L5、LC3 mRNA表達

2.2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

結(jié)果顯示Beclin1、UCH-L5、LC3在初發(fā)組中表達增強，并隨危險度分級升高而升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在緩解組表達較初發(fā)組減弱(P<0.05)，見表2。

表2 不同治療階段Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

注：初發(fā)組與健康組、緩解組比較，P<0.05；緩解組與對照組比較，P>0.05。

2.3 自噬誘導劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

自噬誘導劑作用后，誘導劑組與對照組比較，beclin1表達增強，UCh-L5基因表達減弱調(diào)，LC-3表達增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 自噬誘導劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

2.4 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

自噬抑制劑作用后，抑制劑組同對照組比較，beclin1表達減弱，UCh-L5基因表達增強，LC-3表達減弱，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 自噬抑制劑作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

2.5 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

治療AML藥物處理后 AML治療組同對照組比較Beclin1表達增強，UCH-L5減弱，LC3增強，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3基因表達

3 討論

自噬是從酵母到哺乳動物的真核細胞均存在的現(xiàn)象，是1個把變性的蛋白質(zhì)、細胞器通過溶酶體通路降解的重要細胞過程，在應激條件下，自噬能為細胞提供能量，維持細胞生存[10]。自噬功能具有兩面性，一方面誘導自噬可抑制腫瘤生長，導致自噬相關(guān)細胞死亡，另一方便，自噬可為癌細胞提供營養(yǎng)，清除氧自由基、損傷的線粒體等，能一定程度上維持癌細胞生存[11-12]。自噬既能抑制癌癥又能促進癌癥的兩面性使其在癌癥不同階段發(fā)揮不同作用。自噬抑制癌癥作用表現(xiàn)在癌癥未發(fā)生時。自噬具有清除損傷的細胞器，像受損的線粒體，避免其產(chǎn)生大量自由基，為防止基因突變，預防細胞癌變做出貢獻。如果自噬能力減弱，會導致受損DNA數(shù)量升高，直接增加了癌癥發(fā)生的風險[13-14]。在癌癥起始階段，自噬功能通常被抑制，以減弱其抑制癌癥的能力，當癌癥已經(jīng)發(fā)生時，自噬憑借其獨特能力，為維持癌細胞生存提高幫助。在化療藥物和放療等應激條件刺激下，癌細胞的自噬水平明顯升高以維持癌細胞生存，在癌癥晚期，自噬活動活躍，可能增加癌癥細胞耐藥性。因此，自噬可能是癌癥的一個治療靶點，有研究顯示自噬抑制劑聯(lián)合mTORCl抑制劑可作為AML的靶向治療藥物[15]。

Beclin1基因近年來被認為是重要的誘導自噬因子，主要作用于自噬啟動階段，是介導其他自噬相關(guān)蛋白準確定位的關(guān)鍵因子，直接參與自噬調(diào)控過程，是潛在的腫瘤抑制基因[16-17]。本研究顯示，Beclin-1基因AML患者中較對照組較健康組和緩解組比較呈現(xiàn)出高表達，同AML的危險度分級呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，這同自噬在癌癥不同階段的作用是相符的，也驗證了自噬在AML中發(fā)揮了作用，說明Beclin-1同AML預后存在關(guān)聯(lián)。可能原因是由于癌變細胞面臨更高的代謝壓力，腫瘤細胞為應對營養(yǎng)缺乏，通過Beclin-1提高自噬水平來維持其存活，在在治療后達到完全釋解后，也恢復到正常表達。UCH-15是去泛素化酶UCH家族的主要成員，同時也屬于泛素-蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體通路主要發(fā)揮和終結(jié)基因和蛋白質(zhì)功能，該通路調(diào)控著包括細胞的增殖、分化、凋亡，蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制、降解，基因的轉(zhuǎn)錄、修復等幾乎所有動植物的生命活動[18-19]。本研究中UCH-L5在AML治療的不同階段表達不同，不同危險度分層中表達存在差異，說明UCH-L5同AML預后存在關(guān)聯(lián)。LC3定位于自噬泡膜表面和前自噬泡，參與自噬體的形成，包括Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型。未發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)存在的是胞質(zhì)可溶性的Ⅰ型LC3，表達正常。自噬發(fā)生時，Ⅰ型LC3與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)化為Ⅱ型 LC3，表達增強。LC3始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，鑒于其含量與自噬泡數(shù)量相對應，LC3成為了自噬的標志性基因[20]。本研究中，LC3表現(xiàn)了同Beclin1一致的表達現(xiàn)象，清晰的現(xiàn)實了自噬在AML中發(fā)揮了作用，也說明LC3同AML預后存在關(guān)聯(lián)。

本研究中，經(jīng)自噬誘導劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-MA和AML化療藥物阿糖胞苷作用后Beclin1、UCH-L5、LC3的基因表達均呈現(xiàn)出明顯變化，差異具有統(tǒng)計學意義，其中Beclin1、LC3作為自噬相關(guān)基因，表現(xiàn)一致，在誘導劑和化療藥物作用下表達增強，而在抑制劑作用下表達減弱，說明可以通過藥物實現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬的水平的目的。而化療藥物阿糖胞苷導致自噬標志物升高，推測可能是由于藥物對癌細胞造成了很大損傷，短期內(nèi)誘發(fā)癌細胞增強自噬機制進行抵抗。UCH-L5的表達變化說明自噬抑制劑和誘導劑以及化療藥物可影響UCH-L5的表達，推測UCH-L5同自噬機制存在一定關(guān)聯(lián)。

綜上，可見Beclin1、UCH15、LC3在AML患者中呈現(xiàn)高表達，且與危險程度分級正相關(guān)，其表達同自噬過程關(guān)系密切，推測可通過藥物調(diào)節(jié)三基因表達實現(xiàn)調(diào)節(jié)自噬而定目的，進而影響AML的治療。