龍彤， 宋鵬， 梁培育， 歐善際， 王聲興

（1.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院耳鼻喉科，海南?？?70216；2.海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，海南?？?70102）

近年來，隨著過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）患病率的顯著升高，AR的防治愈來愈受重視[1]。肥大細胞是AR發(fā)病過程中的主要效應細胞，活化的肥大細胞分泌多種促進局部炎癥反應的細胞因子[2，3]。抑制肥大細胞功能是緩解AR進展的有效途徑。

歐前胡素（imperatorin）屬于6，7-呋喃香豆素，是常用中藥蛇床子、白芷、防風、當歸、明黨參、獨活的主要藥效成分之一[4]，也是元胡止痛片、傷痛寧片、通竅鼻炎片、天麻頭痛片等中成藥的質(zhì)檢標準成分[5-10]。歐前胡素具有廣泛的藥理作用，如鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素可有效抑制肥大細胞活化及脫顆粒，從而發(fā)揮治療過敏性炎癥的作用[11]。

大鼠嗜堿性白血病細胞（ratbasophilic leukemia cells，RBL-2H3）是一種常用的肥大細胞脫顆粒體外檢測細胞模型，其表面表達IgE高親和力受體，可用于過敏原鑒定、診斷和潛在免疫治療分析[12-14]。本研究采用IgE誘導RBL-2H3細胞活化脫顆粒這一致敏模型，模擬AR鼻部變態(tài)反應，探討不同劑量的歐前胡素對RBL-2H3細胞脫顆粒及細胞因子分泌的影響，以期闡明歐前胡素治療AR的作用機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養(yǎng) 大鼠嗜堿性白血病細胞RBL-2H3購自中國科學院上海細胞庫。將裝有RBL-2H3細胞的凍存管從液氮罐中取出，復蘇后培養(yǎng)于含體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM中，并放置于37℃，體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 歐前胡素標準品購自北京索萊寶科技有限公司。大鼠組胺、白細胞介素（IL）-3、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環(huán)氧化酶2（COX-2）和干擾素γ（IFN-γ）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購自武漢華聯(lián)科生物技術有限公司；DMEM購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；抗二硝基酚（dinitrophenol，DNP）IgE單克隆抗體（anti-DNP IgE）、4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide試劑購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白（DNP-BSA）購自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；Trizol試劑購自美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TARAKA公司；SYBR Green PCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 儀器DMIL LED倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；MK3酶標儀（芬蘭LabsystemsMultiskan MS公司）；CFX-Connect96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；JY045-3C凝膠成像系統(tǒng)（北京君意公司）。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）測定細胞活力 收集對數(shù)生長期的RBL-2H3細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL接種于96孔板中，90μL/孔，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，分別加入不同劑量（0、2、5、10、15、20μmol/L）的歐前胡素，每組設置3個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20μL濃度為5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，各孔加入150μL二甲基亞砜溶液，搖床振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。酶標儀測定各孔于490 nm處的吸光度（D），計算各組細胞的生長抑制率。公式：生長抑制率=（D0μmol/L-D其他濃度）/D0μmol/L×100%。

1.5 模型構建[15]及給藥 收集生長狀況良好的RBL-2H3細胞，胰蛋白酶消化細胞，并調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，接種于48孔板中，200μL/孔。除正常對照組外，其他組均加入體積分數(shù)10%胎牛血清和200 ng/mL anti-DNP IgE溶液，培養(yǎng)過夜。PBS清洗3次，將歐前胡素溶于臺式液中，按照低濃度（5μmol/L）、中濃度（10μmol/L）和高濃度（15μmol/L）分別加入培養(yǎng)板中，繼續(xù)孵育1 h，加入500 ng/mLDNP-BSA刺激RBL-2H3細胞。

1.6底物顯色法測定脫顆粒率DNP-BSA刺激各組RBL-2H3細胞6 h后，回收細胞培養(yǎng)液上清，再加入200μL含0.1%TritonX-100的臺式液裂解細胞。將上清液和裂解液分別加入96孔板中，每孔加入100μL 12 mmol/L 4-methyl-umbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide試劑作為底物，37℃條件下反應30min，酶標儀測定各孔D（450 nm）。脫顆粒計算公式：脫顆粒率=D上清（/D上清+D細胞裂解液）×100%。

1.7 ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ的釋放水平DNP-BSA刺激各組RBL-2H3細胞15min后，回收細胞培養(yǎng)液上清，按照ELISA試劑盒說明書測定上清液中的組胺含量。DNP-BSA刺激細胞24 h后，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定細胞上清液中的IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ濃度。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測細胞內(nèi)IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ mRNA表達量DNP-BSA刺激各組細胞24 h后，1 000 r/min離心5min，棄上清。PBS清洗3次，采用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達量（p）。各基因引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步兩兩比較采用SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素對RBL-2H3細胞生長的影響MTT法檢測不同濃度的歐前胡素干預RBL-2H3細胞24 h后的細胞活力，結(jié)果如圖1所示，隨著濃度的升高，細胞抑制率逐漸升高。根據(jù)本實驗結(jié)果，20μmol/L歐前胡素的細胞生長抑制率陡增，考慮到該濃度對細胞毒性作用大，故篩選歐前胡素5μmol/L為低劑量組干預濃度，10μmol/L為中劑量組濃度，15μmol/L為高劑量組濃度。

2.2 歐前胡素對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響 與正常對照組比較，模型組脫顆粒率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，不同劑量組的脫顆粒率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），且高劑量組效果更顯著。提示歐前胡素可抑制RBL-2H3細胞脫顆粒行為，并呈一定的劑量依賴性。結(jié)果見圖2。

表1 RT-PCR引物序列Figure 1 RT-PCR primer sequences

圖1 不同濃度歐前胡素對RBL-2H3細胞生長的影響Figure 1 The effectof different concentrations of im peratorin on grow th of RBL-2H3 cells（，n=3）

2.3 歐前胡素對RBL-2H3細胞分泌因子的影響 與正常對照組比較，模型組RBL-2H3細胞上清液中組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α和COX-2水平顯著升高（P＜0.05），而IFN-γ含量顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)不同濃度歐前胡素處理過的RBL-2H3細胞上清液中組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α和COX-2水平顯著低于模型組（P＜0.05），IFN-γ含量顯著高于模型組（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)果見表2。

圖2 歐前胡素對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響Figure 2 The effectof imperatorin on degranulation of RBL-2H3 cells（，n=3）

2.4 歐前胡素對RBL-2H3細胞分泌因子基因表達水平的影響 通過RT-PCR法檢測RBL-2H3細胞內(nèi)IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ基因表達水平，結(jié)果如圖3所示。與正常對照組比較，模型組IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA表達水平升高，IFN-γmRNA表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，歐前胡素低、中、高劑量組IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2 mRNA表達水平降低，IFN-γ mRNA表達水平升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。

表2 各組RBL-2H3細胞釋放組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ水平比較Table 2 Com parison of the release levels ofhistam ine，IL-3，IL-4，IL-6，TNF-α，COX-2 and IFN-γin RBL-2H3 cells of various groups（，n=3）

表2 各組RBL-2H3細胞釋放組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γ水平比較Table 2 Com parison of the release levels ofhistam ine，IL-3，IL-4，IL-6，TNF-α，COX-2 and IFN-γin RBL-2H3 cells of various groups（，n=3）

①P＜0.05，與正常對照組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常對照組模型組歐前胡素低劑量組歐前胡素中劑量組歐前胡素高劑量組組胺[ρ/（ng·mL-1）]0.43±0.006 2.68±0.008①1.86±0.003②1.56±0.016②0.87±0.014②IL-3[ρ/（pg·mL-1）]437.11±67.70 2426.66±16.23①1323.62±13.18②1001.49±12.47②709.48±14.95②IL-4[ρ/（pg·mL-1）]57.79±1.37 239.65±2.05①179.30±1.28②142.51±1.50②70.63±0.72②IL-6[ρ/（pg·mL-1）]43.26±1.34 240.22±1.70①179.85±1.83②155.17±1.16②109.39±1.28②TNF-α[ρ/（pg·mL-1）]43.01±2.10 357.53±1.16①248.44±2.50②206.38±0.75②116.27±2.16②COX-2[ρ/（pg·mL-1）]441.67±7.77 1774.01±18.98①1285.25±18.31②1012.85±20.64②659.38±11.95②IFN-γ[ρ/（pg·mL-1）]202.92±0.95 47.55±1.56①83.97±0.64②115.08±1.16②162.89±0.92②

3 討論

IgE誘導肥大細胞活化、脫顆粒，肥大細胞活化脫顆粒是Ⅰ型超敏反應的關鍵步驟，抑制RBL-2H3細胞嗜堿性顆粒的脫落可有效抑制炎癥反應[15]。本研究檢測并計算了不同劑量歐前胡素處理下的RBL-2H3細胞脫顆粒率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組細胞脫顆粒率顯著升高，而經(jīng)過歐前胡素干預后，RBL-2H3細胞脫顆粒率下降，且呈現(xiàn)出劑量依賴性，高劑量組下降更明顯。提示歐前胡素可抑制過敏性炎癥細胞模型嗜堿性顆粒的脫落。肥大細胞活化、脫顆粒的同時也會釋放組胺，并分泌與炎癥反應相關的細胞因子。

組胺是一種致炎致敏因子，與組胺受體結(jié)合后發(fā)揮其活性作用，導致炎癥反應、變態(tài)反應產(chǎn)生[16]。組胺是AR臨床癥狀的核心炎性因子，刺激鼻黏膜末梢神經(jīng)進而引起鼻癢和打噴嚏，增大血管通透性引起鼻分泌亢進，并刺激炎性細胞因子和黏附因子的分泌[17]。

Th1/Th2細胞比例失衡參與了AR的發(fā)生發(fā)展過程，IFN-γ為Th1細胞分泌抗炎因子，而IL-4則為Th2細胞分泌的代表性促炎細胞因子，因此，IFN-γ/IL-4水平的失衡與AR密切聯(lián)系[18]。劉萍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，AR模型小鼠血清中IL-4、TNF-α水平顯著升高，而IFN-γ水平顯著降低。IgE引起的AR早期過敏反應中，產(chǎn)生的TNF-α等原炎性因子刺激Th2細胞分泌促炎細胞因子[20]。Feng等[21]發(fā)現(xiàn)IgE介導的RBL-2H3過敏性炎癥細胞模型中IL-4、TNF-α釋放增多，COX-2表達升高，從而導致COX-2產(chǎn)物前列腺素E2（PGE2）和前列腺素D2（PGD2）的水平升高，PGE2的增加可能介導輔助T細胞分泌炎性因子加劇炎癥反應，故抑制COX-2有助于抗過敏作用。IL-3和IL-6作為炎性細胞因子，在AR動物模型中的表達也出現(xiàn)顯著上調(diào)[22，23]。在本研究中，IgE誘導的RBL-2H3過敏性炎癥細胞模型釋放的組胺、IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2水平顯著高于正常對照組，且其在細胞內(nèi)的基因表達也顯著上調(diào)，而IFN-γ的表達下調(diào)，提示模型組細胞炎性反應加劇。經(jīng)過不同劑量的歐前胡素治療后，各炎癥指標的表達及釋放均受到顯著抑制，而參與免疫調(diào)節(jié)的IFN-γ的表達顯著上調(diào)，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

圖3 各組RBL-2H3細胞IL-3、IL-4、IL-6、TNF-α、COX-2和IFN-γmRNA表達水平比較Figure 3 Com parison of them RNA expression levels of IL-3，IL-4，IL-6，TNF-α，COX-2 and IFN-γin RBL-2H3 cells of various groups（，n=3）

綜上所述，歐前胡素可顯著抑制RBL-2H3細胞脫顆粒，并降低組胺及各炎癥指標的釋放，促進IFN-γ表達，通過免疫調(diào)節(jié)降低細胞的炎癥反應。該研究結(jié)果可為AR的臨床治療提供理論基礎，但仍待進一步在動物模型中進行驗證。