楊 赟 陳夢(mèng)嬌 杜慶鑫 朱景樂(lè) 杜紅巖 楊紹彬*

(1.國(guó)家林業(yè)和草原局泡桐研究開(kāi)發(fā)中心,經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450003； 2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210000； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，鄭州 450002)

杜仲(Eucommiaulmoides)隸屬于杜仲科(Eucommiaceae)，單屬單種，染色體2n=2X=34，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，在我國(guó)北緯22°～42°，東經(jīng)100°～121°的廣大范圍內(nèi)均可栽培[1]。杜仲因其適應(yīng)性強(qiáng)，干型通直，冠型優(yōu)美，主根較深，側(cè)根發(fā)達(dá)，具有較好的水土保持能力，被廣泛用于園林綠化和防止水土流失[2～3]。當(dāng)前，對(duì)于杜仲的研究主要集中在藥理功效、成分分析、栽培模式，干旱脅迫響應(yīng)等方面[4～6]，對(duì)選育觀賞型杜仲良種報(bào)道較少?！t葉’杜仲(Eucommiaulmoides‘Hongye’)是中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院選育的觀賞型良種，葉片鮮紅至紫紅色，是理想的綠化樹(shù)種?！t葉’杜仲葉片呈紅色的主要物質(zhì)是花色苷[7]，其葉片花色苷含量顯著高于普通杜仲，但是‘紅葉’杜仲葉片的呈色機(jī)理尚不清楚。

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，擁有參考基因組的物種越來(lái)越多，全基因組重測(cè)序技術(shù)在發(fā)掘與植物表型相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)方面發(fā)揮著重要作用。研究者利用該技術(shù)，快速得到這一物種某個(gè)體的基因組信息和重要功能基因的序列信息，初步定位和鑒定差異位點(diǎn)，為從分子水平研究植物基因調(diào)控提供了依據(jù)[8～10]。植物葉片的呈紅色的物質(zhì)是花色苷，花色苷代謝途徑是目前研究的最透徹的通路之一?；ㄉ沼杀奖彼峤?jīng)過(guò)一系列的酶催化合成，由上游基因群和下游基因群控制酶的合成，上游基因群通常編碼參與黃酮、黃酮醇和糅紅合成相關(guān)的酶，下游基因群編碼合成花青苷和原花青素的酶[11]。本研究通過(guò)重測(cè)序技術(shù)檢測(cè)并分析控制‘紅葉’杜仲與普通綠葉杜仲葉色差異的基因位點(diǎn)，比較與葉色形成相關(guān)的酶基因位點(diǎn)差異，開(kāi)發(fā)杜仲紅葉性狀SNP標(biāo)記。

1 研究方法

1.1 研究材料

‘紅葉’杜仲(Eucommiaulmoides‘Hongye’)和‘小葉’杜仲(Eucommiaulmoides‘Xiaoye’)均是在河南洛陽(yáng)地區(qū)通過(guò)實(shí)生選育方法獲得的無(wú)性系良種。本研究以3年生‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲嫁接苗為對(duì)象(砧木均為普通杜仲)，每個(gè)無(wú)性系選擇3個(gè)單株，每個(gè)單株選擇頂端中上部的3片葉片，按無(wú)性系將葉片分組后置于液氮中保存。

1.2 DNA提取

按照Qiagen公司的DNeasy Plant Mini Kit試劑盒的操作步驟提取杜仲DNA，使用Nano Drop 2000進(jìn)行DNA純度檢測(cè)，Picogreen方法檢測(cè)DNA濃度。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，檢測(cè)前將樣品放在冰上融化后，充分混勻并離心。每個(gè)無(wú)性系3個(gè)單株，從中取等量的質(zhì)量較好的DNA混合建庫(kù)，用于二代測(cè)序。

1.3 全基因組重測(cè)序

將檢驗(yàn)合格的基因組DNA樣品(樣品量>2 μg，樣品濃度>50 ng·μL-1，無(wú)色素污染，無(wú)明顯RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染)，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。利用超聲波將DNA序列片段形成隨機(jī)片段，經(jīng)過(guò)處理后用磁珠吸附富集基因組長(zhǎng)度為400 bp左右的片段，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增形成測(cè)序文庫(kù)。質(zhì)檢合格的文庫(kù)用Illumina HiSeqTM平臺(tái)進(jìn)行基因組重測(cè)序，測(cè)序策略為Illumina PE150，總測(cè)序讀長(zhǎng)為300 bp。

1.3.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控與過(guò)濾

原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw Data)經(jīng)過(guò)Fastp(v0.11.5)進(jìn)行質(zhì)控，包括堿基含量分布和堿基錯(cuò)誤率分布。堿基含量分布檢查有無(wú)AT、GC分離現(xiàn)象。測(cè)序堿基序列錯(cuò)誤率結(jié)果由于Illumina HiseqTM測(cè)序的技術(shù)特點(diǎn)，測(cè)序片段前端幾個(gè)Cycles和末端的錯(cuò)誤率會(huì)偏高。使用NGSQCtoolkit(v2.3.3)套件對(duì)raw reads去除接頭等對(duì)reads進(jìn)行trimming，去除低質(zhì)量read并剪切掉5′端及3′端3 bp堿基并過(guò)濾掉長(zhǎng)度小于50 bp的reads。最終得到質(zhì)量較好的Clean Data。測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾采用Fastp默認(rèn)參數(shù)流程[12]。

1.3.2 變異位點(diǎn)檢測(cè)及注釋

對(duì)于‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲測(cè)序獲得的Clean Data，利用BWA(v0.7.16)基于MEM算法[13]將其比對(duì)到杜仲參考基因組序列上(杜仲參考基因組葉片為綠色)，利用GATK(v3.8.0)對(duì)BAM文件進(jìn)行校正[14]，并進(jìn)行SNP檢測(cè)。利用GATK軟件的Haplotyper算法進(jìn)行變異位點(diǎn)檢測(cè)。利用SnpEff(v4.3)進(jìn)行SNP變異位點(diǎn)功能注釋[15]，包括變異位點(diǎn)位置和功能注釋；SnpEff會(huì)根據(jù)變異位點(diǎn)對(duì)蛋白編碼的影響，從高到低依次分為High、Moderate、Low和Modifier 4個(gè)等級(jí)，High代表嚴(yán)重影響功能的SNP個(gè)數(shù)，Moderate代表中度影響功能突變的SNP；Low代表低影響程度；Modifier表示與功能無(wú)關(guān)的SNP。因此，只關(guān)注High和Moderate的個(gè)數(shù)。

1.3.3 變異基因的功能注釋和代謝通路分析

利用Diamond軟件比對(duì)到NR、UniProt和Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)。使用KOBAS軟件比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋基因所涉及的代謝通路。利用emappe軟件比對(duì)EggNog數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋基因功能。

1.3.4 變異位點(diǎn)的篩選

首先根據(jù)變異位點(diǎn)對(duì)蛋白編碼的影響，構(gòu)建導(dǎo)致蛋白發(fā)生High、Moderate變化的基因集。根據(jù)變異基因的功能注釋，篩選與類黃酮和花色苷合成途徑相關(guān)的基因集。為了保證SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，過(guò)濾掉低質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，要求SNP深度≥10X。選取‘紅葉’杜仲與參考基因組完全不一致的純合位點(diǎn)，‘小葉’杜仲與參考基因組完全一致的純合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)被用于SNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)。

1.4 基于Sanger測(cè)序SNP驗(yàn)證

參考杜仲基因組序列信息，采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物，退火溫度在60°左右，引物長(zhǎng)度18～30 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：外顯檢測(cè)引物離外顯子上下游150 bp左右；目的基因測(cè)序的PCR產(chǎn)物條帶一般不超過(guò)1 200 bp。PCR反應(yīng)體系：50 μL：1～2 μL的50 ng·μL-1cDNA，上下游引物、dNTP(mix)均2 μL(10 mmol·L-1), 10×Taq Buffer(with MgCl2) 5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，加雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min; 然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8 min，4℃結(jié)束。Sanger測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

本次測(cè)序質(zhì)量較好?！t葉’杜仲獲得14.16 G數(shù)據(jù)量，47 032 423個(gè)Clean reads，其中堿基質(zhì)量Q30比例達(dá)到91.72%，GC含量為35.54%?！∪~’杜仲獲得14.29 G數(shù)據(jù)量，47 476 746個(gè)Clean reads，其中堿基質(zhì)量Q30比例達(dá)到91.93%，GC含量為35.43%。數(shù)據(jù)質(zhì)控分析顯示，除了reads的前幾個(gè)堿基存在正常的不平衡現(xiàn)象外，堿基質(zhì)量分布基本無(wú)AT、GC分離現(xiàn)象，測(cè)序堿基錯(cuò)誤率分布統(tǒng)計(jì)低于0.001%。

2.2 變異位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 比對(duì)參考基因組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

杜仲參考基因組大小為1.23 Gb，組裝水平是Scafflod(Scafflod N50=1.88 Mb)。比對(duì)參考基因組，‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲測(cè)序數(shù)據(jù)的Mapped Ratio均為99.90%。本研究?jī)蓸颖緦?duì)參考基因組(排除N區(qū))的平均覆蓋深度為10×左右，1×覆蓋深度(至少有一個(gè)堿基的覆蓋度)為87.77%以上。本研究覆蓋到參考基因組的區(qū)域較多，可檢測(cè)到的變異位點(diǎn)較多，基因組上堿基的覆蓋深度分布較均勻，測(cè)序的隨機(jī)性好。

2.2.2 SNP的檢測(cè)

在‘小葉’杜仲中共檢測(cè)到5 711 141個(gè)SNP，其中發(fā)生轉(zhuǎn)換(Ti)的SNP有4 139 309個(gè)，發(fā)生顛換(Tv)的SNP有1 565 071個(gè)，Ti/Tv比值為2.64，在‘紅葉’杜仲中共檢測(cè)到5 407 823個(gè)SNP，其中發(fā)生轉(zhuǎn)換(Ti)的SNP有3 915 050個(gè)，發(fā)生顛換(Tv)的SNP有1 487 022個(gè)，Ti/Tv比值為2.63。

2.2.3 SNP差異位點(diǎn)對(duì)蛋白編碼影響的評(píng)估

在‘小葉’杜仲中存在嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)功能的SNP為1 640個(gè)，中度影響功能的SNP為47 192個(gè)。在‘紅葉’杜仲中存在嚴(yán)重影響功能的有1 516個(gè)SNP，含有中度影響的41 328個(gè)SNP。

2.2.4 SNP差異位點(diǎn)功能注釋

SnpEff每個(gè)變異類型的功能統(tǒng)計(jì)如表1所示。某一基因在‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲間存在堿基差異?！t葉’杜仲和‘小葉’杜仲每個(gè)SNP類型在數(shù)量上差異不大，可能它們分布在不同基因上，導(dǎo)致了‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲在表型上的差異。

2.3 變異基因的功能分類

2.3.1 變異基因的NR、Uniprot、GO、KEGG、EggNOG注釋

含有變異位點(diǎn)的26 722基因，在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋到13 408條基因，在Uniport中注釋到14 418條基因，在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到21 453條基因，在EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋22 660條基因，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到5 915條基因。為了進(jìn)一步研究含有突變位點(diǎn)的基因功能，向GO數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)term進(jìn)行映射(圖1)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞組分(cellular component)中注釋到核、細(xì)胞質(zhì)、膜的有機(jī)組成部分，在生物進(jìn)程(biological process)中注釋到等離子體膜，在分子功能(molecular function)中注釋到蛋白結(jié)合、線粒體和葉綠體、ATP結(jié)合及轉(zhuǎn)錄過(guò)程。根據(jù)KEGG注釋信息，如表2所示，含有差異位點(diǎn)的基因可注釋到286條代謝途徑，其中較多的是淀粉和蔗糖代謝，苯丙素生物合成途徑等，與植物葉片生長(zhǎng)及顏色密切相關(guān)。利用EggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，如圖2所示，有12 977個(gè)位點(diǎn)注釋到25個(gè)類別，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(1 220,9.38%)、轉(zhuǎn)錄(868,6.68%)、蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運(yùn)、分子伴侶(838,6.45%)碳水化合物的運(yùn)輸和代謝(801,6.16%)等類別注釋到的變異位點(diǎn)多，其次是能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換(527,4.05%)，次生代謝產(chǎn)物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝(456,3.51%)。

圖1 GO功能富集分類前20位統(tǒng)計(jì)圖 橫坐標(biāo)表示位于功能區(qū)屬于High和Moderate類型的變異位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，縱坐標(biāo)表示GO Term的ID。Fig.1 GO function enrichment classification chart The abscissa indicates the number of variant sites located in the functional area belonging to the High and Moderate types,and the ordinate indicates the ID of the GO Term.

圖2 COG功能分類圖 A. RNA加工和修飾；B.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C.能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D.細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分配；E.氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F.核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G.碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；H.輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；I.脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；J.翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生；K.轉(zhuǎn)錄；L.復(fù)制，重組和修復(fù)；M.細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；N.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性；O.翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，分子伴侶；P.無(wú)機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q.次生代謝產(chǎn)物的生物合成，分解代謝；S.功能未知；T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U.細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸；V.防御機(jī)制；W.細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y.核結(jié)構(gòu)；Z.細(xì)胞骨架Fig.2 COG function classification chart A. RNA processing and modification; B. Chromatin structure and dynamics; C. Energy production and conversion; D. Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E. Amino acid transport and metabolism; F. Nucleotide transport and metabolism; G. Carbohydrate transport and metabolism; H. Coenzyme transport and metabolism; I. Lipid transport and metabolism; J. Translation,ribosomal structure and biogenesis; K. Transcription; L. Replication,recombination and repair; M. Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. Cell motility; O. Posttranslational modification,protein turnover,chaperones; P. Inorganic ion transport and metabolism; Q. Secondary metabolites biosynthesis,and catabolism; S. Function unknown; T. Signal transduction mechanisms; U. Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V. Defense mechanisms; W. Extracellular structures; Y. Nuclear structure; Z. Cytoskeleton

表1 SNP突變位點(diǎn)功能注釋統(tǒng)計(jì)表

Table 1 SNP mutation site function annotation statistics table

類型Type‘紅葉’杜仲E.ulmoides‘Hongye’‘小葉’杜仲E.ulmoides‘Xiaoye’5′ 端非翻譯區(qū)5_prime_UTR_variant53下游Downstream707591753545基因間區(qū)Intergenic region48268425097746內(nèi)含子區(qū)Intron variant503340532407外顯子區(qū)域的錯(cuò)義突變Missense variant4132843402非編碼轉(zhuǎn)錄本區(qū)Non coding transcript variant1810內(nèi)含子左側(cè)連接區(qū)Splice acceptor variant188197內(nèi)含子右側(cè)連接區(qū)Splice donor variant124149距離內(nèi)含子或外顯子2bp的剪切區(qū)Splice region variant55275952突變導(dǎo)致啟動(dòng)子缺失Start lost165181突變導(dǎo)致終止子獲得Stop gained753807突變導(dǎo)致終止子突變Stop lost287307突變導(dǎo)致終止子的編碼改變Stop retained variant8288同義突變Synonymous variant4051742898上游Upstream gene variant759898809593

2.3.4 用于分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的SNP位點(diǎn)篩選

根據(jù)基因功能注釋的5大數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，26 722條含有差異位點(diǎn)的基因中共有228條基因注釋到與花色苷和類黃酮合成相關(guān)。228條基因內(nèi)部共有829個(gè)差異位點(diǎn)，根據(jù)SnpEff注釋，46個(gè)位點(diǎn)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，783個(gè)位點(diǎn)中度影響蛋白質(zhì)功能。與參考基因組比，‘紅葉’杜仲中存在的這228條基因，含有27個(gè)位點(diǎn)嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中有15個(gè)純合位點(diǎn)；有556個(gè)位點(diǎn)中度影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，269個(gè)純合位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)最終篩選，得到12個(gè)位點(diǎn)在‘紅葉’杜仲中完全差異于參考基因組，且‘小葉’杜仲中的這12個(gè)位點(diǎn)與參考基因組一致，測(cè)序深度均≥10×(表3)。這12個(gè)位點(diǎn)分布在6條基因的內(nèi)部(表4)。

表2 杜仲重測(cè)序的KEGG代謝途徑分類圖

Table 2 Classification of KEGG metabolic pathways forEucommiaulmoidesresequencing

編號(hào)Number途徑PathwayDifferent sites with KEGG annotation(12997)ko ID1淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism183(1.41%)ko005002植物—病原互作Plant-pathogen interaction164(1.26%)ko046263苯丙素的生物合成Phenylpropanoid biosynthesis128(0.98%)ko009404碳代謝Carbon metabolism125(0.96%)ko012005植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)Plant hormone signal transduction105(0.81%)ko040756氨基酸的生物合成Biosynthesis of amino acids103(0.79%)ko012307核糖體Ribosome98(0.75%)ko030108內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工Protein processing in endoplasmic reticulum98(0.75%)ko041419戊糖和葡萄糖醛酸酯互變Pentose and glucuronate interconversions92(0.71%)ko0004010氨基糖和核苷酸糖代謝Amino sugar and nucleotide sugar metabolism92(0.71%)ko0052011RNA運(yùn)輸RNA transport73(0.56%)ko0301312糖酵解和糖質(zhì)新生Glycolysis/Gluconeogenesis72(0.55%)ko0001013嘌呤代謝Purine metabolism67(0.52%)ko0023014剪接體Spliceosome64(0.49%)ko0304015真核生物核糖體生物起源Ribosome biogenesis in eukaryotes60(0.46%)ko0300816半乳糖代謝Galactose metabolism59(0.45%)ko0005217內(nèi)吞作用Endocytosis59(0.45%)ko0414418氰氨基酸代謝Cyanoamino acid metabolism57(0.44%)ko0046019細(xì)胞周期Cell cycle55(0.42%)ko0411020抗壞血酸和新陳代謝Ascorbate and aldarate metabolism54(0.42%)ko00053

表3 12個(gè)與紅葉性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)

表4 篩選出的6條基因的功能注釋

表5 SNP的驗(yàn)證結(jié)果

圖3 基于SNP標(biāo)記的紅葉性狀的初步分子鑒定Fig.3 Preliminary molecular identification of red leaf traits by SNP markers

2.4 Sanger測(cè)序結(jié)果

基于重測(cè)序數(shù)據(jù)和SNP位置設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，一代測(cè)序的驗(yàn)證結(jié)果與重測(cè)序篩選結(jié)果，匹配率100%。共篩選出12個(gè)分子標(biāo)記用于‘紅葉’杜仲紅葉性狀的早期鑒定(表5)。圖3給出了表5中序號(hào)1和2的SNP驗(yàn)證結(jié)果。

3 討論

杜仲是單科單屬單種，‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲均是在河南洛陽(yáng)地區(qū)通過(guò)實(shí)生選育得到的無(wú)性系良種，遺傳背景相對(duì)較小。本研究在參考杜仲基因組大小(1.18 G)的基礎(chǔ)上，前期按10×的測(cè)序深度，后期在分析中設(shè)定嚴(yán)格的閾值，同時(shí)再進(jìn)行部分sanger測(cè)序驗(yàn)證，以期盡可能準(zhǔn)確地得到SNP位點(diǎn)。根據(jù)重測(cè)序結(jié)果，在‘紅葉’杜仲中共檢測(cè)到5 407 823個(gè)SNP，583個(gè)位點(diǎn)能夠嚴(yán)重或者中度影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，且與花色苷合成相關(guān)。目前也有一些學(xué)者采用同樣的方法得到類似的結(jié)論，如Ni等[16]對(duì)日本杏紅綠皮果實(shí)2個(gè)品種的全基因組重測(cè)序分析，對(duì)CDS區(qū)域6個(gè)序列數(shù)據(jù)集的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)181 331個(gè)SNPs，3 318個(gè)InDels和51 427個(gè)SVs，篩選出與紅色果皮顏色形成相關(guān)的13個(gè)候選基因。Xu等[17]對(duì)兩種栽培葡萄株系的幼苗葉片進(jìn)行基因組重測(cè)序，篩選出635個(gè)sbc特異性基因和665個(gè)sbbm特異性基因，分析了非同義突變與控制顏色形成的基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NCED6表達(dá)與NCED1有關(guān)，并可能影響花青素積累。此次研究可能存在一些未覆蓋的位點(diǎn)，得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性也可能有一定偏差，今后我們會(huì)加大群體和測(cè)序規(guī)模，繼續(xù)深入開(kāi)展相關(guān)研究。

‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲除了葉片顏色外葉形也存在一定差異，我們?cè)诜治鲋墟i定的是與花色苷合成相關(guān)的代謝通路，以盡量避免其他因素的干擾。目前多種研究方法共同揭示花色苷代謝途徑中SNP位點(diǎn)差異被廣泛使用。Jiao等[18]在14種中國(guó)野生葡萄品種的樣本中克隆了調(diào)節(jié)花色素苷生物合成的mybA的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子VvmybA1和VlmybA2，在測(cè)序的片段中檢測(cè)到總共121個(gè)SNP，這些SNPs分布在啟動(dòng)子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和編碼區(qū)。Liu等[19]利用MISA、GATK3和注釋工具，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從毛茛花瓣151,136個(gè)單基因中，鑒定和定位SSR和SNP標(biāo)記。在8個(gè)花青素合成關(guān)鍵酶基因家族的116個(gè)單基因中，鑒定出127個(gè)SNP。ANS酶基因中沒(méi)有SNP位點(diǎn)，而DFR酶基因具有最大量的SNP位點(diǎn)。Oh等[20]利用全基因組重測(cè)序檢測(cè)SNP和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析黑米花青素的合成調(diào)控，發(fā)掘到9個(gè)候選基因中的3個(gè)基因與花色苷的合成有很好的相關(guān)性，尤其是基因Os06t0192100(UDP糖基轉(zhuǎn)移酶)與之前報(bào)道的Os04g0557500基因相似性很高。這樣聯(lián)合分析的方法為我們進(jìn)一步深入研究‘紅葉’杜仲花青素的系統(tǒng)進(jìn)化和基因通路提供了思路。在本研究結(jié)合‘小葉’杜仲的重測(cè)序結(jié)果與一代測(cè)序，發(fā)現(xiàn)12個(gè)純合差異位點(diǎn)是‘紅葉’杜仲特有的，更驗(yàn)證了12個(gè)與‘紅葉’杜仲紅葉性狀相關(guān)的SNP位點(diǎn)。下一步將選擇葉色有差別的杜仲，通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序的方法對(duì)上述SNP位點(diǎn)開(kāi)展進(jìn)一步驗(yàn)證。

導(dǎo)致‘紅葉’杜仲葉片特殊呈色的原因可能會(huì)有很多，如基因變異、基因表達(dá)量的差異及表觀遺傳修飾的不同等，本研究?jī)H從基因?qū)用嫱ㄟ^(guò)SNP位點(diǎn)差異初步探討‘紅葉’杜仲呈現(xiàn)紅色的可能原因，至于確切的原因，還需進(jìn)一步的探索。