段鳳敏 張紹旺 邵維炯 高華磊 匡興貴 饒杰 保志娟

摘要：以云南鳳慶大葉種曬青毛茶為原料，在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken實驗設計及響應面分析法，研究乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時間對曬青毛茶茶多酚提取率的影響，同時通過超氧陰離子、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力評價曬青毛茶茶多酚的抗氧化性能。結果表明，0.2g茶粉在固定超聲波功率為160W下，預測最佳提取工藝為：乙醇濃度60.01%，液料比49.28：1mL/g，超聲時間25min，超聲溫度30℃，總多酚得率為19.905%（驗證值為19.83%）。云南大葉種曬青毛茶茶多酚具有很強的抗氧化能力，對超氧陰離子、羥基自由基、DPPH自由基清除的ICso值分別為7.96μg/mL、7.22μg/mL、0.433μg/mL。

關鍵詞：大葉種;曬青毛茶;茶多酚;響應面分析;抗氧化活性

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）05-0066-08

收稿日期：2018-12-14;收到修改稿日期：2019-01-25

基金項目：國家質檢總局科技計劃項目（2017QK191）;云南農業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2018-180）

作者簡介：段鳳敏（1978-），女，云南鳳慶縣人，高級工程師，碩士，從事化學計量及標準物質研究。

通信作者：保志娟（1978-），女，云南曲靖市人，副教授，博士，主要從事標準物質研制與化學計量方面的研究。

0 引言

由于得天獨厚的自然氣候條件，云南擁有豐富的茶樹種質資源。大葉種茶樹是山茶科山茶，屬山茶種（Camellia sinensis），是在云南特殊生態(tài)環(huán)境條件下生長繁衍的具有自身獨特個性的栽培品種，分為喬木、小喬木等類型[1]。云南大葉種茶主要包括勐庫大葉種、鳳慶大葉種和勐海大葉種等?！傍P慶大葉種”，以云南省臨滄市鳳慶縣為中心，主要分布在滇西與滇南茶區(qū)。云南大葉種茶葉含有豐富的茶多酚、咖啡堿等功能成分[2]。茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類物質的總稱，是兒茶素類（黃烷醇類）、黃酮及黃酮醇類、花青素類、酚酸及縮酚酸類、聚合酚類等化合物的復合體[3]。茶多酚中黃烷醇（兒茶素）類化合物是形成茶葉色香味的主要成份之一，也是茶葉中有保健功能的主要成份之一[1]。近年研究表明，茶多酚等活性物質還具有解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質侵入骨髓，被健康及醫(yī)學界譽為“輻射克星”和“天然抗氧化劑”，在食品、保健品、化妝品等領域有廣泛的應用前景[4]。如何提取測定茶多酚已成為食品和茶葉科學研究的熱點[5-6]。

超聲波輔助提取茶多酚具有時間短、效率高的優(yōu)點，結合響應面分析可以獲得最佳的提取工藝，已成為茶多酚提取的有效方法之一[7-10]。目前，云南鳳慶大葉種茶中對茶多酚的提取研究較少。因為茶多酚在極性溶劑中具有優(yōu)良的溶解性，目前浸提茶多酚多采用水、乙醇等極性溶劑[11]，研究表明乙醇提取比水提取茶多酚時間更短[4]。因此，本研究以云南臨滄產的鳳慶大葉種曬青毛茶為原料，采用超聲波輔助提取法，以乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度為考察因素，研究了不同提取工藝參數(shù)對茶多酚提取率的影響，通過響應面優(yōu)化提取工藝條件，并對最佳工藝下得到的茶多酚提取物進行體外抗氧化活性評價，以期為云南鳳慶大葉種曬青毛茶的開發(fā)和抗氧化劑資源篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

市購云南臨滄產鳳慶大葉種曬青毛茶（秋茶），于40℃烘箱內干燥2～3h，用粉碎機粉碎，過40目篩，密封避光保存。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）購于上海源葉生物科技有限公司。沒食子酸，福林酚試劑、碳酸鈉、乙醇等試劑均為國產分析純。

1.2 主要試驗儀器

分光光度計：WFJ200，尤尼柯（上海）儀器有限公司;電子天平：AR224CN（精確到0.1mg），奧豪斯儀器（常州）有限公司;超聲波清洗機：臺式數(shù)控KQ5200DE（超聲頻率40kHz，最大超聲功率200W），浙江昆山超聲清洗儀器有限公司;臺式離心機：TDL-5013，上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶多酚標準曲線

用移液管分別移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL質量濃度為1mg/mL沒食子酸標準母液于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻配成系列濃度標準溶液。用移液管分別移取系列沒食子酸工作液各1.0ML于刻度試管內，在每個試管內分別加入5.0mL的10%福林酚試劑，搖勻。反應5mim，加入4.0mL7.5%NaCO，溶液，加水定容至刻度、搖勻。室溫下放置60min，測定765nm波長下的吸光度。根據沒食子酸工作液的吸光度與濃度，制作標準曲線。

1.3.2 茶多酚提取率的測定

準確稱取粉碎后的茶葉粉末樣品0.2g于試管中，加入一定量的乙醇溶液，在超聲波清洗器中，固定超聲功率為160W，在一定的超聲溫度條件下，處理一定的超聲時間，離心，吸取上清液于100ML的容量瓶中，用水定容為樣品母液。準確移取樣品母液1.0mL正于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻得到樣品待測液。取1.0mL待測液按照上述

1.3.1 測定方法加入10%福林酚試劑和7.5%NaCO₃溶液，測定765皿波長下的吸光度。由標準曲線，計算出茶多酚的提取率，計算公式為：

茶多酚提取率=ρ×X×V/m×100%式中：ρ——溶液中茶多酚質量濃度，mg/mL;

X——稀釋倍數(shù);

V——濾液體積，mL;

m——樣品質量，g。

1.3.3 茶多酚單因素試驗

準確稱取0.2g茶葉，分別考察了乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間對茶多酚提取率的影響。

1.3.4 響應面法優(yōu)化茶多酚提取工藝

在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度為Box-Behnken試驗設計自變量，以茶多酚提取率為實驗設計的響應值，優(yōu)化云南鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取工藝條件。響應面設計實驗因素及水平見表1。

1.3.5 茶多酚提取液抗氧化活性實驗[12-14]

1）超氧陰離子清除活性測定

在總體積為5mL的溶液中加入4mL Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液及不同體積的待測樣品，定容為5mL，于25℃恒溫水浴放置20min。加入0.2mL預熱過的鄰苯三酚（10mmol/L，溶于10mmol/L鹽酸中）引發(fā)反應，準確反應5min后，加入60μL0.1mol/L的抗壞血酸水溶液終止反應，以相應的抗壞血酸水溶液為空白，于1h內測定420mm波長下的吸光度A。其抑制率計算公式為：

抑制率%=[1-（A₃-A₄）]/A₁-A₂×100%式中：A₁——不含樣品的吸光度值;

A₂——不含樣品和鄰苯三酚的吸光度值;

A₃——含有樣品的吸光度值;

Ax±s——含樣品，但不含鄰苯三酚的吸光度值。

2）羥基自由基清除活性測定

分別向5支試管中加入1mL 8.8mmol/L FeSO₄、1mL 9.1mmol/L水楊酸-乙醇溶液、1ML不同濃度茶多酚提取樣品液和5mL蒸餾水，再加入1ML0.06%H₂O₂啟動反應，立即放入37℃水浴鍋中保溫30min后，以蒸餾水為參比，測定510mn波長下的吸光度值，記為Al。用1ML的蒸餾水代替1ML的H₂O₂，按上述同樣的方法測定吸光度值，記錄為A₂。用1ML蒸餾水代替1ML樣品，按上述同樣的方法測定吸光度值，記錄為A₃。

羥基由基抑制率/%[A₃-（A₁-A₂）]/A₃×100%

3）DPPH自由基清除活性測定

配制濃度為2.0×10^-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液。取2.0mL DPPH溶液，加入不同體積的茶多酚提取樣品溶液，用水定容為5mL，放置30min后，測定吸光度。

抑制率%=（A₀-A_i）/A₀×100%式中：A₀——2.0mL DPPH溶液定容為5mL時的吸

光度;

A_i——2.0mL DPPH溶液加入樣品溶液后，定容為5n止時的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度的影響

準確取0.2g茶葉，配置乙醇體積分數(shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，在液料比50：1mL/g，超聲溫度40℃，超聲20min的條件下進行樣品提取，考察乙醇濃度對茶多酚提取率的影響，每個條件平行3次，不同乙醇濃度對茶多酚提取率的影響如圖1所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，茶多酚提取率呈先上升后下降的趨勢，在70%處達到最大值。因此實驗選定60%、70%、80%乙醇體積分數(shù)為Box-Behnken實驗的三個水平。

2.1.2 液料比的影響

準確取0.2g茶葉，乙醇體積分數(shù)為70%，超聲溫度40℃、超聲20min的條件下進行樣品提取，考察不同液料比（20：1、30：1、40：1、50：1、60：1、70：1mL/g）對茶多酚提取率的影響。不同的液料比對茶多酚提取率的影響如圖2所示，當液料比為20：1（mL/g）到40：1（mL/g）時，提取率隨著液料比的加大，有持續(xù)上升的趨勢，在液料比40：1（mL/g）時，含量達到最高，這是因為液料比增大在一定程度上提高了傳質推動力。但是在液料比大于50：1（mL/g）后，茶多酚提取率變化較小，表明此后物質不再溶出。由于液料比過大會造成浪費，故試驗以40：1（mL/g）為最佳液料比，選定30：1、40：1，50：1（mL/g）液料比為Box-Behnken實驗的3個水平。

2.1.3 超聲溫度的影響

準確取0.2g茶葉，乙醇體積分數(shù)為70%，液料比50：1（mL/g）、超聲20min，考察不同的超聲溫度（30，40，50，60，70℃）對茶多酚提取率的影響。不同的超聲溫度對茶多酚提取率的影響如圖3所示，當溫度為30～50℃時，隨著溫度上升，提取率不斷增加，當溫度為40℃時，提取率最高，為16.55%，當溫度超過40℃后，提取率隨著溫度的增加反而有所下降，但是當溫度為60℃時，茶多酚含量再次升高，達到16.43%，在提取溫度為30～70℃時，出現(xiàn)了兩個最佳提取溫度，分別為40℃和60℃，溫度過高，會造成溶劑揮發(fā)損失，因此試驗以40℃為最佳提取溫度，選定30℃、40℃、50℃的提取溫度為Box-Behnken實驗的3個水平。

2.1.4 超聲時間的影響

準確取0.2g茶葉，乙醇體積分數(shù)為70%，液料比50：1（mL/g），超聲溫度40℃，考察不同的超聲時間（5，10，15，20，25，30，35min）對茶多酚提取率的影響。不同的超聲時間對茶多酚提取率的影響如圖4所示，隨著超聲提取時間的增加，茶多酚提取率呈現(xiàn)緩慢增加達到最高點再下降的趨勢，當時間到達30min時，提取率最高，為16.68%，當時間超過30min，提取率略有下降，因此試驗以30min為最佳超聲提取時間，選定超聲提取時間為25，30，35min試驗因素水平。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken實驗設計和響應面優(yōu)化結果

根據單因素試驗，采用Box-Behnken實驗設計原理進行四因素三水平實驗設計，并利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行數(shù)據擬合，優(yōu)化茶多酚的提取工藝，在單因素試驗的基礎上，以乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度4個自變量的實驗水平分別以-1，0，1進行編碼，以茶多酚提取率為響應值，設計了四因素三水平的二次回歸旋轉正交試驗，共有29組試驗，其中24個試驗為分析因子，5次試驗為零點，不同實驗設計及結果如表2所示。

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用軟件對表中的數(shù)據進行多元回歸擬合，獲得茶多酚提取率（Y）對自變量乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）的二次多元回歸模型方程：Y=18.12+0.030A+0.39B-0.071C-0.29D-0.27AB+0.29AC+0.044AD+0.35BC+0.23BD+0.19CD-0.087A²+0.12B²+0.16C²+0.68D²

回歸方程的方差分析數(shù)據見表3，回歸模型差異極顯著（P<0.0001），失擬檢驗值不顯著（P=0.3803>0.05），說明模型可以擬合實驗結果，擬合度良好。決定系數(shù)（r²）0.9446和調整后決定系數(shù)（r_ADJ²）0.8893，表明預測值和實測值之間具有高度的相關性;CV值為0.98%，說明模型方程能夠很好地反映真實的實驗值，具有可重復性。

回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗結果顯示：模型中一次項（B和D）和二次項（D²）（P<0.0001）差異極顯著;交互項（AB、AC、BC）（P<0.01）差異較顯著;交互項（BD）和二次項（C²）（P<0.05）差異顯著。

2.2.3 響應面圖分析

響應面圖是回歸方程的形象描述，圖5直觀反映了乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度的響應曲面的形狀對茶多酚提取率的影響。圖5（a、b、c）及（b、d、e）分別為乙醇濃度、超聲時間與其他3個因素交互作用對茶多酚提取率的影響。乙醇濃度、超聲時間對茶多酚的提取率來說并不顯著。圖5（a、d、f）為料液比與其他3個因素對茶多酚提取率的影響。從圖中可以看出，相比其他因素，料液比對茶多酚的提取率的影響更為顯著，隨著料液比的增加，茶多酚提取率增加。圖5（c、e、f）為超聲溫度與其他3個因素對茶多酚提取率的影響。因為溫度增加，使溶劑的粘度降低，加快了介質傳遞，從而導致茶多酚提取率隨溫度的升高明顯增大。各因素對茶多酚提取率的影響的大小順序為：液料比（B）>超聲溫度（D）>超聲時間（C）>乙醇濃度（A）。另外，從圖5中的a、b、d的圖形可以看出，乙醇濃度與料液比，乙醇濃度與超聲時間，料液比與超聲時間的交互作用較顯著，這與回歸分析相一致。

2.2.4 優(yōu)化與驗證試驗

由Design-Expert.V8.0.6軟件回歸模型分析，得出的茶多酚的最佳提取條件是：乙醇濃度60.01%、液料比49.28：1（mL/g），超聲時間25min，超聲溫度30℃，在此條件下模型預測的最大提取率為19.905%?？紤]到試驗條件的可操作性，將提取工藝的參數(shù)調整為：乙醇濃度60%，液料比50：1（mL/g），超聲時間25min，超聲溫度30℃，在此條件下做八次驗證試驗，茶多酚提取率為19.83%、與預測值的相對誤差0.38%<5%，說明該模型能較好地預測實際提取量，具有較好的可行性和實用價值。

2.3 茶多酚體外抗氧化活性的測定

利用上述最優(yōu)提取工藝對云南鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚進行提取，試驗分別測定了茶多酚提取物對超氧陰離子（O₂^-）、羥基自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）的抑制率IC₅₀值。

2.3.1 茶多酚提取液清除超氧陰離子（O₂^-）的測定

鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取液對超氧陰離子（O₂^-）的清除作用由圖6所示。從圖中可以看出，在0～11μg/mL濃度范圍內，曬青毛茶中茶多酚對超氧陰離子（O₂^-）的清除率隨著濃度增加而逐漸升高，但當?shù)竭_sμg/mL時，超氧陰離子（OZ）的清除率隨茶多酚濃度的增加而趨于平緩。茶多酚清除超氧陰離子（O₂^-）的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）約為7.96μg/mL。

2.3.2 茶多酚提取液清除羥基自由基（·OH）的測定

鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚提取液對羥基自由基（·OH）的清除作用由圖7所示。從圖中可以看出，在0～5μg/mL濃度范圍內，隨著曬青毛茶中茶多酚濃度的增加，茶多酚對羥基自由基（·OH）的清除率隨濃度增加而逐漸升高。茶多酚清除羥基自由基（·OH）的ICsa計算為7.22μg/mL。

2.3.3 茶多酚提取液清除DPPH自由基（DPPH·的測定

DPPH的乙醇溶液為深紫色，最大吸收波長為517mm，當抗氧化劑存在時，DPPH的溶液將會褪色。鳳慶大葉種曬青毛茶中茶多酚對DPPH自由基（DPPH·）的清除作用由圖8所示。從圖中可以看出，較低的茶多酚濃度對DPPH自由基（DPPH·）就有較高的清除率，但當濃度到達1.2μg/mL時，DPPH自由基（DPPH·）的清除率曲線變化趨于平緩。茶多酚清除DPPH自由基（DPPH·）的IC₅₀計算為0.433μg/mL。

3 結束語

1）利用超聲波輔助提取了云南臨滄產鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚，研究了乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度對提取率的影響。利用響應面分析法優(yōu)化了曬青毛茶中茶多酚提取的最佳工藝條件（固定超聲波功率160W）為：乙醇濃度60.01%，液料比49.28：1，超聲時間25min，超聲溫度30℃。在此條件下茶多酚的提取率為19.83%，與預測值之間的相對誤差僅為0.38%，表明試驗設計工藝條件可靠。

2）經過3種體外抗氧化指標試驗，表明云南臨滄產鳳慶大葉種曬青毛茶中的茶多酚具有較強的抗氧化性，其清除超氧陰離子（O₂^-），羥基自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）IC₅₀值分別為7.96μg/mL，7.22μg/mL，0.433μg/mL。

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（編輯：徐柳）