劉穎昳（編譯）

（中國動物疫病預防控制中心，北京 102600）

1 簡介

非洲豬瘟是一種豬的病毒性疾病，可導致家豬的高死亡率，同時在天然的野豬儲存宿主中表現(xiàn)為無癥狀。ASF 導致重要的經(jīng)濟損失，在缺乏有效疫苗的情況下幾乎無法避免，目前的疾病控制方式主要是對感染地區(qū)的隔離檢疫和對受感染豬只的撲殺。ASF 由ASF 病毒引起，這是一種具有復雜分子結構的雙鏈DNA 病毒。ASFV 是Asfarviridae 家族中唯一的成員，也是唯一由節(jié)肢動物（Ornithodoros屬的軟蜱）傳播的DNA 病毒。軟蜱（Ornithodoros moubata）參與非洲豬瘟病毒和歐洲O. erraticus 的叢林傳播循環(huán)。與家豬有相似急性癥狀的野豬似乎與ASFV 在歐洲的傳播周期相關。

這種病毒引起的疾病最早是20世紀20 年代在肯尼亞發(fā)現(xiàn)。隨后即被局限在非洲，直至20 世紀中期蔓延到歐洲，后來擴展到南美洲和加勒比地區(qū)。 20 世紀90 年代，歐洲通過嚴格的控制和根除計劃（撒丁島除外）凈化了這種疾病。然而，在2007 年，ASFV 再次從非洲蔓延到高加索地區(qū)，特別是格魯吉亞，并在2014 年到達歐盟的東部領土。越來越多的歐盟國家，波蘭和3 個波羅的海國家開始報告這一疾病的發(fā)生，最近是在摩爾多瓦。由于缺乏具有保護功效的疫苗，ASF對所有歐洲國家都構成嚴重威脅。ASF 在非洲東部和南部的傳播已經(jīng)證實了其流行復雜性，ASFV 具有22 種基因型，主要基于編碼主要衣殼蛋白p72 的B646L 基因的C 末端區(qū)域的序列變異特征來區(qū)分。最近，報道了一種新的基因型，即基因型XXIII，具有基因型IX 和X 的共同祖先，由東非國家和剛果共和國流行的分離株組成。文章總結了ASFV 的現(xiàn)狀。

2 非洲豬瘟病毒

ASFV 是一個較大的具有包膜的病毒，具有二十面體形態(tài)，平均直徑為200 nm。病毒基因組由單個線性、共價封端的雙鏈DNA 組成。不同分離株的基因組長度在170 ～190 Kbp 之間變化，編碼151 ～167 個開放閱讀框。ASFV復制主要是在細胞質，但細胞核也是早期病毒DNA 合成的部位。鄰近病毒基因組開始復制部位的薄層網(wǎng)絡發(fā)生分解，以及多種核蛋白重新分布，均表明在病毒感染期間存在調節(jié)細胞內(nèi)核的復雜機制。

病毒基因的轉錄受到有力地調控。目前，已經(jīng)通過獨特的積累動力學，包括早早期，早期、中 期 和 晚 期（immediate-early，early， intermediateand late）轉 錄 產(chǎn)物來確定四類mRNA。早早期和早期基因在DNA 復制開始之前表達，而中期和晚期基因在之后表達。中期基因的存在說明存在級聯(lián)模式可調節(jié)ASFV 基因的表達。病毒從部分未包被的核心顆粒進入細胞質，使用包裝在病毒顆粒中的酶和其他因子，之后則立即表達出DNA 復制所需的酶。病毒在病毒工廠和DNA 復制的主要晚期完成形態(tài)建立。

3 病毒粒子結構

ASFV 顆粒具有由幾個同心結構域組成的二十面體形態(tài)：由中心基因組形成的內(nèi)核包含核仁，其被稱為核殼的厚蛋白質層包覆；然后是圍繞內(nèi)核的內(nèi)部脂質包膜；最后是衣殼，這是細胞內(nèi)病毒粒子的最外層。細胞外病毒顆粒具有額外的外部包膜，當病毒通過質膜出芽時產(chǎn)生。然而，這種包膜對病毒感染并非必要，其重要性尚不清楚。

4 病毒進入機制

ASFV 感染周期始于病毒吸附和進入宿主細胞。對于ASFV 進入機制的早期研究將此事件描述為低pH 和溫度依賴性過程，與Vero 細胞和豬巨噬細胞中可飽和及特異性受體介導的內(nèi)吞作用一致。然而，該病毒的受體仍然未知。ASFV 的有限細胞嗜性表明感染需要巨噬細胞特異性受體。ASFV 對豬巨噬細胞和單核細胞的感染與CD163 清道夫受體的表達相關，這是巨噬細胞成熟的標志之一。之前有報道提出這是一種可能的病毒受體，因為針對這一分子的單克隆抗體能夠阻斷原發(fā)性肺泡巨噬細胞的感染。然而，最近的研究表明CD163 不是感染Georgia 2007/1 病毒分離株所必需的受體。使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)得到的將CD163 基因完全敲除的基因編輯豬顯示，臨床癥狀、死亡率、病理學或病毒血癥沒有差異。這些研究的一個結論是雖然CD163 可能是必需的，但對于感染而言還不足夠，其他巨噬細胞表面蛋白也可能參與感染過程。

雖然目前有證據(jù)支持受體依賴的病毒進入機制，例如網(wǎng)格蛋白介導的動力蛋白依賴性內(nèi)吞作用，但是也有證據(jù)表明ASFV 還可利用其他機制，如吞噬作用和巨噬細胞增多癥。此外，膽固醇是ASFV 成功進入所必需的。當使用適合該細胞系的病毒分離株時，這些機制在巨噬細胞靶細胞和Vero 細胞中均可發(fā)生。

此外，一些ASFV 蛋白參與了進入機制，如p30，對病毒內(nèi)化很重要，而其他蛋白如p12 和p54 經(jīng)鑒定為潛在的病毒附著蛋白。

5 ASFV 進入內(nèi)體通路

ASFV 感染最終應到達內(nèi)吞途徑。一旦病毒進入內(nèi)吞途徑，其必須通過不同的內(nèi)吞體群體才能實現(xiàn)成功感染（圖1）。內(nèi)吞途徑的成熟受到募集到內(nèi)體膜的蛋白質和脂質精確調控。Rab GTPase 蛋白家族是內(nèi)吞成熟途徑的主要調節(jié)因子，其中Rab 家族的每個成員特異性定位在不同的內(nèi)體區(qū)室。吸附后的幾分鐘內(nèi)，在用Rab5和EEA1 標記物標記的早期內(nèi)體（early endosomes，EE）中發(fā)現(xiàn)了入侵病毒。事實上，完整的衣殼化病毒粒子只能在EE 水平上發(fā)現(xiàn)，而在其他成熟的酸性區(qū)室中卻沒有。用bafilomycin A1 抑制內(nèi)體酸化可以阻止病毒的脫衣殼作用，但是只有在這種情況下，才有可能在CD63 陽性的多泡內(nèi)體和表達Rab7的晚期內(nèi)體中觀察到完整病毒。在正常情況下，晚期內(nèi)體內(nèi)僅有缺乏衣殼蛋白的病毒內(nèi)核。

其中涉及發(fā)動蛋白和網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用。僅幾秒鐘即可通過內(nèi)吞途徑進展并到達成熟的內(nèi)體區(qū)室，在這里會發(fā)生病毒脫衣殼和內(nèi)部病毒薄膜與內(nèi)體膜的融合。新合成的病毒體在病毒工廠中組裝，并通過胞質膜上的胞吐作用或通過形成凋亡小體離開細胞。

在感染后30 ～45 min 之間，在成熟內(nèi)體區(qū)室中的酸性腔內(nèi)發(fā)生病毒脫衣殼。成熟的內(nèi)體區(qū)室是表達CD63 的多泡體，其特征在于存在管腔內(nèi)囊泡以及表達Rab7 的晚期內(nèi)體。對于其他病毒，連續(xù)病毒脫殼和穿透也對內(nèi)體成熟具有依賴性。一旦脫殼，病毒顆粒暴露內(nèi)包膜，允許其相互作用，隨后將該病毒膜與內(nèi)體的限制性膜融合，并且裸露內(nèi)核可以釋放到細胞溶質中開始復制。這一過程強烈依賴于內(nèi)體膜上的膽固醇流出。事實上，在這一水平上阻斷膽固醇轉運會導致病毒顆粒滯留在內(nèi)體內(nèi)，從而抑制感染進展。內(nèi)包膜病毒蛋白pE248R 也參與病毒融合。該蛋白與痘病毒進入/融合復合物的某些成員具有序列相似性。

其他內(nèi)體成熟抑制劑，如渥曼青霉素（wortmannin），一種阻斷早期內(nèi)體融合的磷脂酰肌醇3（phosphatidylinositol 3，PI3）激 酶抑制劑，以及擾亂微管依賴性內(nèi)體轉運的抑制劑諾考達唑也可預防ASFV 感染。

圖1 ASFV 通過復雜過程進入宿主細胞

6 ASFV 基因表達和DNA 復制

進入的ASFV粒子應當?shù)竭_其在靠近微管組織中心（microtubule organizing center，MTOC）的核周區(qū)域的復制位點。早早期和早期基因在DNA 復制開始之前表達。兩條DNA 鏈都是用作編碼鏈的替代品，這可能是通過包裝在病毒核心中的參與病毒轉錄的多種酶的作用來實現(xiàn)。DNA 復制后，開始進行中期和晚期基因的轉錄。ASFV 基因組約占其mRNA 轉錄和修飾所涉及的基因的20%。這種轉錄機制使ASFV 與宿主相對獨立，并對其基因表達進行精確的時空調控。雖然核在病毒復制中的確切作用仍不清楚，但已經(jīng)通過原位雜交和放射自顯影在感染細胞的切片中確定了ASFV 的DNA 復制中核階段的存在。在堿性蔗糖梯度中進行復制病毒DNA 的沉淀分析，結果顯示在病毒DNA 復制的早期，小DNA 片段在細胞核中被脈沖標記，而較大的分子在細胞質中于后續(xù)時間內(nèi)合成。在ASFV 感染的細胞的細胞核和細胞質中合成的復制中間體由頭對頭的多聯(lián)體組成。細胞核可能提供引發(fā)病毒復制所需的小轉錄子或其他因子，或者應該發(fā)生病毒DNA 復制的早期階段。

7ASFV 和凋亡

ASFV 感染后的ER 應激反表現(xiàn)為caspase 12 的激活，其與線粒體caspase 9 和效應caspase 3 的激活具有相似的時間動力學。細胞凋亡是一種重要的預防病毒感染的先天細胞機制，多種病毒已經(jīng)進化出對這種細胞反應的抑制或延遲策略。因此，ASFV A179L 基因編碼抗凋亡的Bcl-2 蛋白的同源物，以延長宿主細胞存活，直到病毒基因組的復制完成。這種病毒Bcl-2 在感染后的早期和晚期都有表達，并抑制多種促凋亡的BH3-only 蛋白的作用，已知其為細胞凋亡的快速誘導因子，例如激活的Bid，BimL，BimS，BimEL，Bad，Bmf，Bik，Puma 和DP5。另 一 種ASFV 基因——A224L，編碼已知為IAP 蛋白的凋亡抑制劑家族成員，能夠抑制半胱天冬酶活化并促進細胞存活。病毒性IAP 不僅可以阻斷caspase-3 活化，還可以激活NF-κB。有趣的是，該病毒編碼一種干擾NF-κB 活化的IκB 樣分子（A238L）。A238L 和A224L 在ASFV 感染期間的不同時間表達，這表明ASFV 在感染早期需要相對低的NF-κB 活性以避免免疫應答，但是在后期需要較高活性，可能在細胞系統(tǒng)被濫用時阻止細胞的凋亡。在ASFV 感染的最晚階段，受感染的細胞經(jīng)歷凋亡，并且顯示程序性細胞死亡的特征形態(tài)變化，包括受感染細胞發(fā)生典型的膜起泡，形成許多含病毒的囊泡，這可能一個有效的病毒傳播體系。

8 ASFV 和自噬

A179L 是非洲豬瘟病毒的病毒Bcl2 同源物，不僅與促凋亡的Bcl2 家族蛋白相互作用以抑制細胞凋亡，而且通過其與BH3 同源結構域的Beclin1 相互作用抑制自噬。與其他DNA 病毒一樣，ASFV 有抵消自噬清除作用的防御體系。其中一個例子是HSV-1 ICP34.5 蛋白，可通過與Beclin1的作用來抑制自噬。ASFV 編碼與ICP34.5 同源的蛋白質，從而發(fā)揮其他功能。ASFV DP71L 抑制激活PP1/蛋白磷酸酶1 的ER 應激反應。然而，與HSV-1 ICP34.5相反，其不會與Beclin1 發(fā)生相互作用。

事實上，ASFV 感染不會在Vero 細胞中誘導LC3 活化或自噬體形成。自噬是相關的細胞防御機制，其允許細胞組分的有序降解和再循環(huán)。自噬消除細胞內(nèi)病原體，并且對先天性和適應性免疫應答具有至關重要的作用。一些DNA 病毒，例如ASFV 和HSV-1，已經(jīng)進化出控制這種細胞反應的策略，以防止新組裝的病毒顆粒的降解。相反，據(jù)報道大多數(shù)RNA 病毒在感染細胞中誘導自噬，并且在一些情況下自噬可以促進病毒復制。

9 ASFV 逸出細胞

成熟的病毒顆粒通過微管介導的機制從病毒工廠轉運到細胞表面，取決于運動蛋白常規(guī)驅動蛋白和衣殼蛋白pE120R。一旦進入細胞表面，粒子就會通過在膜上出芽而離開宿主細胞，從而獲得額外的包膜。 細胞內(nèi)和細胞外病毒都具有感染性，但結構和抗原性不同，這可能對宿主對ASFV 的免疫反應具有重要意義。

10 潛在的疫苗和抗病毒藥物

之前針對ASFV 疫苗的開發(fā)嘗試均未能誘導保護性免疫。目前，有幾項基于減毒活ASFV（live attenuated ASFV，LAV） 的實驗疫苗可引發(fā)保護作用，其中包括在基因組中敲除單個或多個基因等方法，包括DNA 疫苗。其中一些有希望能轉化為成功的候選疫苗。如今，可用的疫苗應當滿足多種要求。任何候選的ASFV 疫苗都應包括可用于區(qū)分受感染或接種疫苗動物的標記，以便進行診斷。而且，由于缺少可支持減毒疫苗病毒復制而不改變病毒毒力的細胞系，疫苗生產(chǎn)尚無法進行。目前，野豬被發(fā)現(xiàn)是波羅的海和波蘭非洲豬瘟傳播的主要參與者。因此，針對這些動物的誘餌活疫苗對于限制疾病傳播至關重要。在目前的情況下，疫苗可以與感染檢測一同進行，以實現(xiàn)對該疾病的凈化?，F(xiàn)有的診斷方法可以實現(xiàn)病毒檢測，同時也可檢測抗體，以鑒別幸存者和無癥狀攜帶者。

在有效疫苗開發(fā)出來之前，依然存在使用抗病毒藥物的可能性?？共《静呗砸褟V泛應用于人類感染，也可用于動物健康領域?？共《舅幬镆部捎糜谠诒┌l(fā)后對病毒傳播進行早期控制。此外，抗病毒藥物與疫苗接種方案的組合可用于引發(fā)免疫應答，從而有效預防疾病。在這里，我們已經(jīng)對潛在的分子靶點進行了綜述，其均可作為抗病毒的目標位點。針對ASFV 的抗病毒藥物包括白藜蘆醇和氧化白藜蘆醇，微藻，膽固醇降低類藥物或膽固醇轉運抑制劑，抗腫瘤月桂基—沒食子酸酯，抗驚厥丙戊酸，發(fā)動蛋白抑制劑，氟喹諾酮類，絲氨酸蛋白酶抑制劑，特異性多肽等。 這些藥物可以最終應用于快速反應，以減少易感動物，以便在暴發(fā)周圍創(chuàng)建“安全區(qū)域”，從而控制感染的傳播。