王 磊

（天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津 300402）

抗生素是養(yǎng)豬業(yè)臨床上應(yīng)用最為廣泛的藥物 ,但由于用藥誤區(qū)，使得養(yǎng)豬場(chǎng)濫用抗生素的現(xiàn)象十分嚴(yán)重 ,至使藥物不良反應(yīng)和耐藥菌株逐年增多，因而對(duì)豬病的預(yù)防和治療工作帶來(lái)很大困難[1]。據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)報(bào)道，濫用抗生素產(chǎn)生藥物殘留也嚴(yán)重威脅著食品安全。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2018年4 月20日啟動(dòng)了“獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)”試點(diǎn)工作，旨在減少獸用抗生素對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)和食品安全的危害。

現(xiàn)代中藥研究表明，多種中藥的有效成分具有治療常見豬病的作用，而且其不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人體的毒副作用小。本實(shí)驗(yàn)旨在篩選對(duì)于生豬養(yǎng)殖中豬源大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌有體外抑制作用，同時(shí)對(duì)飼料中的益生菌—枯草芽孢桿菌抑制作用小的中藥提取物，用以替代獸用抗生素。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

生物堿類：黃柏小檗堿、苦參堿；香豆素類：白芷香豆素；皂苷類：三七總皂苷（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）、三七葉皂苷、皂莢皂苷、仙人掌皂苷、土茯苓皂苷；青霉素（購(gòu)自哈藥六廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

豬源大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 皂苷的提取分離

正丁醇萃取法，分段沉淀法[2]

1.3.2 生物堿的提取分離

聲波提取法[2]

1.3.3 香豆素提取分離

堿溶酸沉法[2]

1.3.4 藥敏片的制備

取定性濾紙，制作成6 mm 的圓片，高壓滅菌后烘干。將中藥提取 物 制 成10 μg/μL 藥 液，取2 mL藥液，將滅菌紙片分別浸泡2 h，將浸泡好的紙片烘干備用。陽(yáng)性對(duì)照藥敏片由濃度為2.5 μg/μL 的青霉素同法浸泡制成。

1.3.5 菌液的制備

分別取實(shí)驗(yàn)菌，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，制成菌液。

1.3.6 抑菌實(shí)驗(yàn)方法：Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法[3]

取內(nèi)徑90 mm 的平底雙碟，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基,備用。菌液分別稀釋100 倍,抽取100 μL菌液注入到培養(yǎng)基上，用涂菌棒涂布均勻，待干燥后，貼上備好的藥敏片。將其置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中18 h 后，量取抑菌圈直徑，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方差。

2 中藥提取物體外抑菌結(jié)果及分析

8 種中藥提取物體外抑菌結(jié)果如表1 所示。

從表1 中可見，8 種中藥提取物均有不同程度的抑菌作用。

對(duì)大腸埃希菌而言，8 種中藥提取物對(duì)其均有抑制作用，但抑制作用最好的是土茯苓皂苷，效果要好于陽(yáng)性對(duì)照青霉素（抑菌圈直徑為14.30 mm）,其抑菌圈直徑為17.00 mm，其他中藥提取物對(duì)大腸埃希菌的抑制效果均未超過(guò)青霉素。

對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最好的是白芷香豆素，其抑菌圈直徑為10.00 mm。抑菌程度稍遜于陽(yáng)性對(duì)照（抑菌圈直徑為12.70 mm）。

苦參堿、皂莢皂苷和三七葉皂苷對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用差不多，抑菌圈直徑均達(dá)到10 mm。

生物堿類中藥提取物（黃柏小檗堿、苦參堿）對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌都有抑制作用，但抑菌效果不及陽(yáng)性對(duì)照。香豆素類中藥提取物對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌的抑制作用與生物堿類差不多，抑菌效果也弱于陽(yáng)性對(duì)照。皂苷中藥提取物對(duì)三種實(shí)驗(yàn)菌的抑制作用差別較大，三七葉皂苷和三七總皂苷兩種中藥提取物的抑菌效果相較于生物堿類及香豆素類提取物抑菌效果相當(dāng)；其他三種皂苷類中藥提取物對(duì)個(gè)別實(shí)驗(yàn)菌表現(xiàn)出了不抑制現(xiàn)象，皂莢皂苷和仙人掌皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑制作用，土茯苓皂苷對(duì)枯草芽胞桿菌沒有抑制作用。

表1 8 種中藥提取物體外抑菌結(jié)果

3 討論

3.1 從中藥提取物的分類看抑菌效果

上述8 種中藥提取物是根據(jù)中藥的療效選擇出來(lái)，再根據(jù)其有效成分的化學(xué)性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛《?。本?shí)驗(yàn)旨在找到既能替代治療豬病的抗生素又對(duì)生豬的益生菌—枯草芽胞桿菌無(wú)抑制作用的中藥提取物，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看生物堿類中藥提取物（黃柏小檗堿和苦參堿）和香豆素類中藥提取物（本實(shí)驗(yàn)只選取白芷香豆素）對(duì)三種試驗(yàn)菌都有抑制作用。皂苷類中藥提取物（本研究選擇了5 種植物皂苷加以實(shí)驗(yàn)研究）抑菌效果有選擇性，土茯苓皂苷對(duì)枯草芽胞桿菌沒有抑制作用，值得進(jìn)一步研究。

3.2 抑菌效果的特異性和廣譜性

如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，土茯苓皂苷抑制大腸埃希菌的能力超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照，而它對(duì)枯草芽孢桿菌沒有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用一般（與其他中藥提取物的抑菌結(jié)果比較）。這一結(jié)果達(dá)到了本次實(shí)驗(yàn)的目的，因?yàn)殛?yáng)性對(duì)照青霉素雖然對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，但同時(shí)也抑制了枯草芽胞桿菌的生長(zhǎng)。抑制枯草芽胞桿菌會(huì)造成生豬食欲不振，影響生豬的生長(zhǎng)速度?？梢钥紤]將土茯苓皂苷做為特異抗菌性的藥物替代廣譜抗生素使用。這樣既達(dá)到甚至超過(guò)了抗生素對(duì)生豬疾病的治療效果，又避免了抗生素對(duì)于生豬養(yǎng)殖的危害，一舉兩得。

其他類的中藥提取物對(duì)3 種實(shí)驗(yàn)菌都有不同抑制作用，并由于其具有獸用抗生素沒有的，在生豬體內(nèi)殘留低的特點(diǎn)，也有繼續(xù)研究的價(jià)值。

3.3 對(duì)有效成分粗提物可繼續(xù)深入研究，提升應(yīng)用價(jià)值

中藥的作用機(jī)制十分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)是中藥粗提物對(duì)生豬常見致病菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)于具有特異抑菌性和廣譜抑菌性的中藥提取物可通過(guò)分離純化技術(shù)進(jìn)一步深入研究，從而確定其具體的抑菌成分，進(jìn)而研究其抑菌作用機(jī)制。此外，還可以通過(guò)純化技術(shù)提高中藥提取物的含量，這樣由于其毒副作用小，含量的提高可能會(huì)提高其抑菌能力，抑菌效果可能會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)生豬養(yǎng)殖中常用的獸用抗菌素，很有開發(fā)前景。

3.4 研究方法和陽(yáng)性對(duì)照的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用藥敏紙片法檢測(cè)中藥提取物抑菌活性。常用的抑菌實(shí)驗(yàn)方法還包括牛津杯法、最小抑菌濃度測(cè)定法等。為了考察中藥提取物的抑菌穩(wěn)定性，可以選擇其他方法共同來(lái)檢測(cè)。但應(yīng)注意每種方法藥物濃度的一致性。

本研究的陽(yáng)性對(duì)照只選取青霉素，對(duì)于中藥提取物特異性和廣譜性抑菌效果的考察還應(yīng)選取其他種類治療豬病的獸用抗菌素進(jìn)行對(duì)照研究。通過(guò)不同類型治療豬病的獸用抗菌藥的共同比對(duì)試驗(yàn)，有助于檢驗(yàn)中藥提取物的抑菌能力。