曹籍文，黃云麗，陳君

(1天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300350；2天津市腦血管與神經(jīng)變性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3天津市神經(jīng)病學(xué)研究所)

近年來(lái)，缺血性腦卒中的發(fā)病率居高不下，是致殘率和致死率最高的疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康[1]。腦梗死發(fā)生后，會(huì)在缺血區(qū)誘發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理過(guò)程，如腦能量代謝紊亂、氧自由基激活及級(jí)聯(lián)反應(yīng)、興奮性氨基酸的毒性作用等。當(dāng)缺血性腦損傷發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞最先被激活，釋放大量促炎癥因子，在神經(jīng)細(xì)胞病理性損害中起重要作用。因此，盡早恢復(fù)缺血區(qū)血流供應(yīng)，減少腦梗死體積，減輕炎癥因子損傷，改善神經(jīng)功能缺損后遺癥狀，是早期臨床治療的關(guān)鍵，而尋找有針對(duì)性的治療藥物也成為學(xué)者們的研究熱點(diǎn)之一。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑，能有效延緩病情進(jìn)展、改善神經(jīng)癥狀、抑制神經(jīng)元凋亡，廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病的臨床治療中。Yuan等[2]證實(shí)，給予依達(dá)拉奉治療后，大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)大鼠缺血區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞與IL-1β、TNF-α、iNOS等促炎性因子共表達(dá)減少，其可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減輕腦神經(jīng)元炎癥反應(yīng)和氧化損傷，在缺血性腦損傷中發(fā)揮腦保護(hù)作用，但其分子靶點(diǎn)和具體作用機(jī)制目前尚不明確。Notch信號(hào)通路維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)發(fā)育，也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究[3,4]證實(shí)，在急性腦缺血發(fā)生即刻，瞬時(shí)活化的γ-分泌酶介導(dǎo)Notch信號(hào)通路激活；Notch-1大量表達(dá)于活化態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞，主導(dǎo)調(diào)控其激活和炎癥因子表達(dá)；Notch信號(hào)通路參與活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，亦有可能通過(guò)調(diào)控下游NF-κB的核轉(zhuǎn)位參與缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程[5]。但依達(dá)拉奉是否通過(guò)Notch信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)道仍少見(jiàn)。2018年8月～2019年1月，我們觀察了依達(dá)拉奉腹腔注射對(duì)大鼠缺血性腦損傷的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠36只，清潔健康8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于無(wú)特殊病原菌環(huán)境中，自由活動(dòng)、飲食飲水。所有大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為Edv組、MCAO組、Sham組各12只。

1.2 大鼠缺血性腦損傷模型制備及依達(dá)拉奉腹腔注射 ①Edv組、MCAO組：均制備缺血性腦損傷模型，即采用Longa等[6]的經(jīng)典線(xiàn)栓法，行MCAO手術(shù)，以制備大鼠缺血性腦損傷模型。大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥，麻醉滿(mǎn)意后，取仰臥位固定，消毒皮膚，取頸正中切口，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)外動(dòng)脈。依次結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈及其分支；頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端穿結(jié)扎線(xiàn)打活結(jié)備用，微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉；眼科剪在頸總動(dòng)脈近分叉處剪一小口。將備好的線(xiàn)栓由此口插入，經(jīng)分叉處沿頸內(nèi)動(dòng)脈入顱至大腦中動(dòng)脈起始部，以阻斷大腦中動(dòng)脈血流。感到輕微阻力時(shí)可停止送線(xiàn)，插入深度約18～21 mm，結(jié)扎線(xiàn)打結(jié)以防止線(xiàn)栓脫出，消毒并縫合皮膚。多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)血流量降至術(shù)前的50%以下，缺血2 h后退出線(xiàn)栓恢復(fù)血供。②Sham組：僅分離暴露血管不做栓塞。術(shù)中直至術(shù)后動(dòng)物麻醉蘇醒均應(yīng)注意保暖。Edv組于MCAO術(shù)后1 h腹腔注射8 mg/kg依達(dá)拉奉，Sham組及MCAO組分別在同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射同量的生理鹽水，連續(xù)3 d。

1.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 造模后24 h，由兩位不明分組的實(shí)驗(yàn)人員觀察大鼠，依照Longa等[6]的改良評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0分，正常，無(wú)明顯行為學(xué)變化；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢；2分，能行走，輕微的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，能行走，嚴(yán)重的向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，不能行走，向?qū)?cè)傾倒；5分，意識(shí)喪失，無(wú)自發(fā)活動(dòng)。

1.4 大鼠腦梗死體積測(cè)算 采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法。造模后5 d各組分別取6只大鼠處死，迅速斷頭取腦，于-20 ℃冷凍30 min后取出。沿冠狀面切片，片厚2 mm。將腦片浸入1%TTC染液中，37 ℃水浴避光孵育30 min，期間翻動(dòng)1次，使染色充分。于4%多聚甲醛中固定24 h后攝片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析計(jì)算腦梗死體積。采用Swanson等[7]的梗死體積間接計(jì)算法，為減少缺血后腦水腫對(duì)梗死體積的影響，以非缺血側(cè)體積與缺血側(cè)非梗死區(qū)體積兩者差值作為校正后的梗死區(qū)體積值，采用其與非缺血側(cè)體積的比值的百分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較。

1.5 大鼠腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。造模后5 d各組另分別取6只大鼠，以2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位暴露心臟，注射器經(jīng)左心室穿刺至主動(dòng)脈，予生理鹽水灌注直至右心耳切口流出清亮液體，再取4%多聚甲醛灌注固定。迅速斷頭取腦，腦組織液氮冷凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ∧X組織稱(chēng)重，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，研磨后靜置，4 ℃下離心，取上清為總蛋白。取腦組織加入預(yù)冷的PBS 1 mL，研磨至勻漿，取上清于4 ℃下離心，棄上清，加入細(xì)胞核提取試劑，高速振蕩混勻15 s，冰上靜置，間斷振蕩，再次離心取上清液，得核蛋白。BCA法蛋白定量后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。將蛋白樣品與4×蛋白上樣緩沖液以1∶3體積混勻，100 ℃煮沸5 min，電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉，加入一抗兔抗大鼠Notch-1單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠NICD多克隆抗體(1∶500)、兔抗大鼠Hes-1單克隆抗體(1∶500)、山羊抗大鼠Iba-1多克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000)和小鼠抗大鼠Histone-1多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；洗膜，加入二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)或兔抗羊IgG-HRP(1∶5 000)，室溫孵育1 h，ECL顯影。采用Image J圖像軟件分析條帶的光密度值，以目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白灰度的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α檢測(cè) 采用ELISA法。取腦組織稱(chēng)重，加入生理鹽水，冰上研磨勻漿，制成10%的腦組織勻漿，4 ℃下離心取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積比較 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死體積比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

2.2 各組腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達(dá)比較 腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白見(jiàn)表2。

表2 各組腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達(dá)比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

2.3 各組腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)比較 腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)比較見(jiàn)表3。

表3 各組腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

3 討論

缺血性腦卒中是一種腦內(nèi)血循環(huán)異常導(dǎo)致的急性缺血性腦損傷，發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、致殘率和病死率極高，嚴(yán)重影響患者壽命和生活質(zhì)量，也給家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)多取決于梗死灶的大小和部位，主要為局灶性的神經(jīng)功能缺損癥狀和體征。目前，靜脈溶栓是臨床上公認(rèn)最有效的恢復(fù)血流、搶救缺血半暗帶組織的治療措施之一[8]。然而，溶栓藥物有著嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，且治療禁忌證眾多，因此能夠通過(guò)溶栓實(shí)現(xiàn)血管再通、改善缺血性腦損傷的仍是少數(shù)，多數(shù)患者除常規(guī)治療外，需要使用神經(jīng)保護(hù)藥物。缺血性腦損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，缺血后炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)功能受損、腦組織形態(tài)改變的重要病理過(guò)程，小膠質(zhì)細(xì)胞激活在其中發(fā)揮重要的作用[9]。激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“巨噬細(xì)胞”，吞噬病原體和細(xì)胞碎片，修復(fù)受損神經(jīng)[10]；但過(guò)度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性因子，導(dǎo)致氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)，反而加重組織損傷，破壞血腦屏障，打亂動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)生更加持久的損害[11]。

依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑和腦保護(hù)劑，被廣泛應(yīng)用于缺血性腦梗死的急性期治療。盡管已經(jīng)證實(shí)，依達(dá)拉奉具有明確的腦保護(hù)作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。依達(dá)拉奉治療缺血性腦損傷的可能機(jī)制包括：①分子量小，脂溶性高，易透過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用；②清除氧自由基，減少細(xì)胞膜損傷；抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，減少蛋白損傷變性，減小梗死灶面積；抑制線(xiàn)粒體凋亡通路，減少神經(jīng)元凋亡；③抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞；調(diào)節(jié)缺血后花生四烯酸代謝，減少腦水腫；④抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥介質(zhì)釋放等[12～15]。研究證實(shí)[16]依達(dá)拉奉能減少腦水腫和梗死灶體積，抑制神經(jīng)元凋亡，延緩神經(jīng)功能癥狀，有效改善急性腦梗死的功能結(jié)局，有益于遠(yuǎn)期預(yù)后。本研究顯示，與Sham組比較，Edv組、MCAO組神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積百分比增加；與MCAO組比較，Edv組神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死體積百分比減少。提示依達(dá)拉奉對(duì)大鼠缺血性腦損傷有治療作用，其可有效改善缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能癥狀，減少腦梗死體積。

Notch信號(hào)通路在γ-分泌酶作用下激活，裂解釋放出Notch-1受體胞內(nèi)活性片段NICD，可不經(jīng)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用而直接進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游靶基因Hes-1、Hes-5、NF-κB等的表達(dá)[17]。以γ-分泌酶為作用靶點(diǎn)可阻斷Notch信號(hào)通路，其中DAPT(GSI)是最為有效的特異性的γ-分泌酶抑制劑，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域[18,19]。Iba-1是一種鈣結(jié)合蛋白，能與巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合；當(dāng)這些細(xì)胞激活后，Iba-1的表達(dá)相應(yīng)上調(diào)，因此常作為反映小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的標(biāo)記物使用[20]。Cao等[21]發(fā)現(xiàn)，靜息及活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子。在生理狀況下，維持小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，通過(guò)任何方式激活Notch通路都會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，產(chǎn)生炎性介質(zhì)浸潤(rùn)損傷神經(jīng)元；體外實(shí)驗(yàn)中，用LPS處理小膠質(zhì)細(xì)胞后，Notch-1受體表達(dá)上調(diào)，阻斷Notch通路則伴隨IL-6、IL-1β及TNF-α等促炎因子表達(dá)降低。在沉默Notch基因或使用γ-分泌酶抑制劑的動(dòng)物模型中，腦損傷狀況和缺血后炎癥反應(yīng)明顯減輕。并且在腦缺血發(fā)生早期抑制Notch信號(hào)通路，能明顯減輕炎癥損傷，更有益于組織修復(fù)；而長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)阻斷Notch信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致血管新生受抑制，影響神經(jīng)再生。說(shuō)明Notch信號(hào)通路在疾病進(jìn)展的不同時(shí)期發(fā)揮著不同的作用[22]。與相對(duì)簡(jiǎn)單的分子結(jié)構(gòu)相比，Notch信號(hào)通路與其他細(xì)胞信號(hào)通路的交互作用可能相當(dāng)復(fù)雜。目前在神經(jīng)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞研究[23]中，Notch通路與NF-κB、Wnt、TGF/BMP、TLR等通路的相互作用已經(jīng)被證實(shí)。本研究顯示，與Sham組比較，Edv組、MCAO組Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達(dá)升高；與MCAO組比較，Edv組Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達(dá)降低。與Sham組比較，Edv組、MCAO組IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；與MCAO組比較，Edv組IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低。提示依達(dá)拉奉對(duì)大鼠缺血性腦損傷有治療作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Notch信號(hào)通路，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥因子釋放而實(shí)現(xiàn)。

總之，依達(dá)拉奉對(duì)大鼠缺血性腦損傷有治療作用，機(jī)制可能為下調(diào)Notch信號(hào)通路、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少炎癥因子釋放。