周廣海，岳華，吳博，金松南，文今福

(山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東泰安 271000)

高血壓是指以體循環(huán)動脈血壓升高為主要特征，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質(zhì)性損害的臨床綜合征，是臨床常見病、多發(fā)病。雖然抗高血壓的藥物不斷問世，然而并沒有有效地控制其發(fā)生發(fā)展趨勢，目前全球發(fā)生率仍呈現(xiàn)居高不下的態(tài)勢，患病率高達(dá)31.1%[1]。長期的高血壓可導(dǎo)致心肌肥厚、心律失常、心功能不全等心臟功能紊亂。因此，高血壓治療目的不僅僅在于控制血壓，更重要的是對其靶器官的保護(hù)。2016年9月～2018年7月，我們通過給原發(fā)性高血壓(SHR)大鼠灌胃大黃素，觀察大黃素對SHR大鼠心臟功能的改善作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 大黃素購自西安嘉天生物科技有限公司，抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗體和抗Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bax)抗體購自Cell Signaling Technology，抗含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)抗體購自Santa Cruz，反轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑購自北京全式金生物，PCR引物由上海生工合成。BL-420S型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川泰盟科技)，Western blot設(shè)備(君意)，Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)定量PCR儀(Qiagen)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物、分組及大黃素灌胃 SHR(收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg)大鼠10只，WKY大鼠5只，均為雄性，8～10周齡，體質(zhì)量200～230 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物的使用遵守山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會要求。10只SHR大鼠分為A、B組各5只，5只WKY大鼠設(shè)定為C組，A組每天灌胃30 mg/kg的大黃素，其余兩組灌胃大黃素溶劑—1%羧甲基纖維素鈉溶液，維持10周。

1.3 大鼠血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)觀察 大鼠灌胃10周后，停藥1 d，腹腔注射1 g/kg烏拉坦麻醉，做頸動脈插管，連接壓力換能器，利用BL-420S型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄動脈血壓(SBP、DBP)，然后插入左心室，5 min后讀取左心室功能指標(biāo)(HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax)。結(jié)束后處死大鼠，并留取心臟和腎臟，凍存于-80 ℃環(huán)境備用。

1.4 心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C檢測 采用熒光定量PCR法。心臟和腎臟中總RNA提取參照試劑盒說明書操作，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。ANP上游引物：5′-ATACAGTGCGGTGTCCAACAC-3′，下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCAAGAG-3′；BNP上游引物：5′-GCTTTGGGCAGAAGATAGACCG-3′，下游引物：5′-AGAAGAGCCGCAGGCAGAG-3′；NPR-A上游引物：5′-GGAAACGCATTGAGTTGACA-3′，下游引物：5′-TGGTGAGCGAGTACCGAAA-3′；NPR-B上游引物：5′-CTCTATGCCAAGAAGCTGTGG-3′，下游引物：5′-CCAGGCCTTCCAAGTAGAAAG-3′；NPR-C上游引物：5′-GGTGACACCATTCGGAGAATC-3′，下游引物：5′-AGCTTGCTTAGCTTCAAAGTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAACG-3′，下游引物：5′-GTGGTTCACACCCATCACAAAC-3′。qPCR反應(yīng)體系中分別加入cDNA模板、目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、SYBR Green混合溶液和水，總體積為20 μL/管，用實(shí)時(shí)定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.5 心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白檢測 采用Western blotting法。取出心臟，按照每10 mg組織后加入100 μL組織裂解液，勻漿，冰上裂解，離心后收集上清，加入上樣緩沖液，煮沸10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品?0 μg/孔上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜后，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用anti-bcl-2、anti-bax、anti-ARC一抗孵育過夜，TBST洗膜后相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，通過上海歐翔科學(xué)儀器有限公司的化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描，使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析條帶，以平均光密度OD值×面積表示蛋白含量，將目的蛋白與內(nèi)參比值作為目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較 血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較見表1。

2.2 各組心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達(dá)比較 心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達(dá)比較見表2。

表1 各組血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

表2 各組心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達(dá)比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達(dá)比較 心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達(dá)比較見表3。

表3 各組心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達(dá)比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3 討論

高血壓是臨床常見疾病，以體循環(huán)動脈壓升高為主要表現(xiàn)，伴或不伴有多種心血管危險(xiǎn)因素，90%以上的高血壓患者屬SHR。高血壓與冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅人類身體健康。長期的高血壓可導(dǎo)致心臟功能紊亂，如心肌肥厚、心律失常、心功能不全等。目前，臨床上常用的降壓藥主要有利尿藥、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑等五大類。此外，中醫(yī)藥在治療高血壓方面也積累了大量經(jīng)驗(yàn)，特別是在治療輕中度高血壓以及部分重度高血壓方面優(yōu)勢顯著，不僅能改善癥狀，提高生活質(zhì)量，還能穩(wěn)定血壓，平穩(wěn)降壓，緩和降壓，改善危險(xiǎn)因素，保護(hù)靶器官，使部分患者達(dá)到停藥減量目的[2]。中藥有效成分如葛根素、白藜蘆醇、丹參酮、原花青素等對于治療高血壓病心血管重塑、緩解臨床癥狀及降低并發(fā)癥上確有療效[3]。

大黃素是從大黃、虎杖和何首烏等廖科中藥材中分離得到的游離型蒽醌類化合物，其藥理作用廣泛，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用，也具有一定的利尿和降壓作用，對疾病的治療作用日益受到國內(nèi)外的重視。研究顯示，大黃素能抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞毒性[4]，抑制高脂飼料誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化的形成[5]，降低大鼠離體胸主動脈的緊張性，使血管擴(kuò)張[6]。大黃素在大鼠心臟中的作用也有報(bào)道，如大黃素減弱自身免疫性心肌炎[7]，抑制腎性高血壓所致的心肌重塑[8]，或抑制糖尿病心肌病[9]。

血流動力學(xué)指標(biāo)HR代表心率，心率越快，心輸出量越大，血壓越高；動脈收縮壓SBP和動脈舒張壓DBP反映外周血壓的高低，高血壓時(shí)二者經(jīng)常同時(shí)升高；左心室收縮壓LVSP、左心室舒張末壓LVEDP和左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率±dp/dtmax是反映心肌舒縮性能的可靠指標(biāo)，其中LVSP、+dp/dtmax反映心臟收縮功能，正值越大，收縮性能越強(qiáng)，而LVEDP、-dp/dtmax反映心臟舒張功能，負(fù)值越大，舒張性能越好。高血壓引起心臟負(fù)荷增加，心肌代償性肥厚，心肌舒縮功能增強(qiáng)，LVSP、LVEDP和±dp/dtmax指標(biāo)數(shù)值變大，當(dāng)心臟失代償即心功能不全后，舒縮功能減弱。本實(shí)驗(yàn)中，SHR大鼠的HR、SBP、DBP、LVSP和±dp/dtmax都明顯高于對照大鼠，而大黃素灌胃10周后SHR大鼠HR、±dp/dtmax都顯著降低，提示大黃素能明顯降低高血壓大鼠的心率，改善左心室舒縮功能，防止心力衰竭的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到大黃素能改善SHR大鼠左心室舒縮功能，這與孔倩倩等[10]報(bào)道大黃素改善缺血/再灌注心臟左心室舒縮功能、Wu等[11]報(bào)道大黃素抑制急性心肌梗死相符合。這些提示大黃素在心血管功能紊亂中發(fā)揮保護(hù)作用。

鈉尿肽(NPs)家族中，ANP和BNP為主要的心臟循環(huán)激素[12,13]，可促進(jìn)鈉尿排泄，擴(kuò)張血管，抑制血管升壓素和腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)，抗心肌纖維化，進(jìn)而產(chǎn)生降低血壓、保護(hù)心血管的作用。我們前期研究[14]發(fā)現(xiàn)，大黃素呈濃度依賴性地促進(jìn)離體心房分泌ANP，提示大黃素可能具有保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用。本研究顯示，SHR大鼠心肌ANP、BNP mRNA表達(dá)增加，這與Jin等[15]報(bào)道的結(jié)果一致，而大黃素干預(yù)則明顯抑制SHR大鼠心肌中兩者mRNA表達(dá)的升高。鈉尿肽的受體有三種，即NPR-A、NPR-B、NPR-C。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NPR-A而不是NPR-B的表達(dá)能誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的肥大；NPR-A缺失小鼠表現(xiàn)為高血壓和左室心肌肥大[16，17]，可見NPR-A具有抑制心肌肥大、保護(hù)心肌的作用。我們發(fā)現(xiàn)，與對照大鼠相比，SHR大鼠心臟NPR-A的表達(dá)沒有明顯變化，與林璋等[18]報(bào)道壓力超負(fù)荷性大鼠左心室NPR-A的表達(dá)呈動態(tài)變化趨勢—早期升高，晚期降低—并不一致，可能與高血壓大鼠的模型、周齡和程度有關(guān)。腎臟中NPR-A、NPR-B mRNA的水平在各組中無顯著差異，但是SHR大鼠腎臟中NPR-C mRNA水平明顯減弱，而大黃素干預(yù)則明顯升高其表達(dá)，這與Li等[19]報(bào)道的NPR-C能降低高血壓的結(jié)果一致，說明大黃素具有潛在對抗高血壓的作用。慢性高血壓會引起心肌重構(gòu)，其發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)常伴有心肌凋亡。本研究結(jié)果表明，SHR大鼠心肌bcl-2的表達(dá)顯著降低且bax表達(dá)明顯升高，使bcl-2/bax降低，而大黃素干預(yù)則明顯抑制此種變化。ARC是一種在心臟中大量表達(dá)的抗凋亡蛋白，具有抑制心肌細(xì)胞調(diào)亡、保護(hù)心肌免受凋亡相關(guān)因子損傷的功能[20]。我們發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠心肌ARC的表達(dá)顯著降低，大黃素干預(yù)能促使其表達(dá)升高。這提示大黃素通過增加bcl-2/bax比值和ARC的表達(dá)，抑制SHR大鼠心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而能改善其心功能。我們所觀察到的大黃素抑制SHR大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的結(jié)果與Wu等[11]報(bào)道的大黃素通過抑制心肌細(xì)胞的死亡來防止急性心肌梗死的結(jié)果相一致。

總之，大黃素對SHR大鼠心臟功能有改善作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控鈉尿肽系統(tǒng)和心肌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，提示大黃素在高血壓致心臟病變的防治方面有潛在的應(yīng)用前景。