李 旭 魏德強(qiáng)

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150040)

雌三醇(μE3) 分子式為 C18H24O3，分子量為288.38 Da。雌三醇是一種半抗原，在體內(nèi)通過雌二醇的代謝而產(chǎn)生，其主要是存在于尿液中的一種天然的雌激素，在胎盤中芳構(gòu)化形成雌三醇[1]。雌三醇在孕婦體內(nèi)含量的變化與巨大兒和唐氏綜合征或愛德華氏綜合征等疾病密切相關(guān)[2-5]。在孕婦體內(nèi)未結(jié)合的雌三醇濃度非常低，則預(yù)示著胎兒存在染色體異常的可能，可能患有愛德華氏綜合征或唐氏綜合征；而雌三醇異常升高，則增加了孕婦懷有巨大兒的風(fēng)險(xiǎn)，因此雌三醇檢測(cè)是篩查孕婦胎兒畸形的重要指標(biāo)，在優(yōu)生優(yōu)育中有著重要作用。

免疫學(xué)方法是利用抗原、抗體間的特異性反應(yīng)對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行分析，從而避免了傳統(tǒng)化學(xué)分析法耗時(shí)耗力的弊端，可以對(duì)μE3等生物學(xué)樣品進(jìn)行直接檢測(cè)分析[6-9]，能夠很大程度地提高檢測(cè)的時(shí)效性和準(zhǔn)確性，給臨床診斷和治療提供了便捷、可靠的保障。然而，μE3為小分子半抗原，不具有免疫原性，很難獲得高特異性和高親和力的單克隆抗體。

近些年來，棒狀煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)通過遺傳方法和化學(xué)方法改變其原有性狀，而被用來作為半抗原的載體。TMV由許多個(gè)結(jié)構(gòu)相同的重復(fù)單元構(gòu)成，均為對(duì)稱結(jié)構(gòu)，這些對(duì)稱的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元可以使多個(gè)半抗原分子在其表面呈高重復(fù)性和高密度的有序排列，相對(duì)于傳統(tǒng)載體BSA等更加有效地提高了半抗原的免疫原性，使半抗原能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈有效的免疫反應(yīng)[10]。本研究擬通過煙草花葉病毒與μE3結(jié)合，提高μE3的免疫原性，來獲得針對(duì)μE3的高親和力的特異性單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 BALB/c小鼠，6～8周齡，雄性，購于中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所；μE3蛋白購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞型鑒定試劑盒購于Roche 公司；TMV-EPMK (賴氨酸突變體煙草花葉病毒)、TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3的化學(xué)鏈接均由長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供；紅細(xì)胞裂解液、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)基添加物(Hypoxantin/aminopterin/thymidin，HAT)、聚乙二醇(分子量1 600)、胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)BS)、次黃嘌呤/胸腺嘧啶脫氧核苷培養(yǎng)基添加物(Hypoxantin/thymidin，HT)、牛血清白蛋白、葡萄球菌A 蛋白(protein A)均購于Sigma公司；無血清培養(yǎng)基MD6 和Sp2/0 細(xì)胞由大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1免疫 小鼠免疫時(shí)間間隔為14 d，三次常規(guī)免疫后再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，具體免疫時(shí)間表如表1 所示。選擇3只BALB/c雄性小鼠，在其背部皮下、腋窩、腹腔及腹股溝采取多點(diǎn)注射的免疫方法，第1次免疫使用弗氏完全佐劑，TMV-EPMK-μE3劑量為每只小鼠40 μg/0.3 ml，14 d后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行第2次免疫，免疫劑量同第1次，再間隔14 d后用弗氏不完全佐劑與第2次相同劑量進(jìn)行第3次免疫。第3次免疫后10 d取小鼠尾部血清，用間接ELISA[10]方法檢測(cè)效價(jià)。腹部加強(qiáng)免疫，不使用佐劑，劑量為每只40 μg/0.3 ml，加強(qiáng)免疫3 d后進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.2細(xì)胞融合與篩選 取加強(qiáng)免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0細(xì)胞按2∶1比例混合在一起，1 000 g離心3 min，棄掉上清，于90 s內(nèi)緩慢滴加聚乙二醇，并迅速加入經(jīng)過37℃預(yù)熱后的培養(yǎng)基，然后放于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱靜止10 min。1 000 g 離心3 min后用添加10% FBS和1% HAT的MD6培養(yǎng)基懸起混勻，用12道移液器加在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中后放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中封閉培養(yǎng)8～10 d。之后在包被TMV-EPMK-μE3蛋白的ELISA板中加入細(xì)胞上清液進(jìn)行間接高通量的ELISA(HTS-ELISA)篩選，并最終將確定的陽性細(xì)胞孔內(nèi)細(xì)胞挑選出來進(jìn)行亞克隆。

1.2.3雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)、抗體的純化 亞克隆后的雜交瘤細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，具體操作方法如下：①亞克隆后的雜交瘤細(xì)胞通過半量換液，逐步從96孔細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中；②通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板，取108個(gè)細(xì)胞接種于1 L 細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞狀態(tài)；③10～14 d后90%以上的細(xì)胞死亡，進(jìn)行離心取細(xì)胞上清液，0.45 μm 的濾膜過濾；④再利用Proten A親和層析對(duì)抗體進(jìn)行純化；⑤獲得抗TMV-EPMK-μE3的抗體經(jīng)透析罐透析濃縮，加入等體積甘油-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4獲得抗體的亞型鑒定 篩選到的單克隆抗體使用羅氏 (Roche) 亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型鑒定，具體操作方法如下：①用1%BSA 的PBS緩沖液將獲得的抗體稀釋至終濃度為1 μg/ml；②在反應(yīng)管中加入 150 μl濃度為 1 μg/ml 的抗體溶液， 25℃ 30 s 后混勻；③將試劑盒內(nèi)亞型鑒定試紙條黑色端朝下插入反應(yīng)管中， 靜止放置 5 min；④試紙條上陽性條帶出現(xiàn)(約5～10 min)即開始觀察結(jié)果，根據(jù)條帶位置對(duì)比判斷獲得的抗體所屬亞型。

1.2.5特異性鑒定 包被TMV-EPMK、TMV-EPMK-μE3和CPMV- μE3， 三種抗原濃度均為0.5 g/ml， 用1×PBSTB將單克隆抗體將濃度配制成10 μg/ml，每個(gè)單克隆抗體配制300 μl，然后進(jìn)行4倍梯度稀釋，對(duì)TMV-EPMK-μE3免疫獲得的單克隆抗體進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定獲得的單克隆抗體的特異性。

表1 免疫接種時(shí)間表

Tab.1 Schedule of immunization

DaysStepsAdjuvantInoculation position0 d1st immunizationFreund′ s complete adjuvantDorsum/Former armpit/Inguinal regions/Abdominal14 d2nd immunizationFreund′ s incomplete adjuvantDorsum/Former armpit/Inguinal regions/Abdominal28 d3rd immunizationFreund′ s incomplete adjuvantDorsum/Former armpit/Inguinal regions/Abdominal38 dThe titer of serum--3 days before fusionBooster immunization-Abdominal

2 結(jié)果

2.1雜交瘤細(xì)胞株的建立 3次免疫結(jié)束后10 d，取小鼠尾部血清測(cè)得效價(jià)如圖1所示。免疫小鼠血清效價(jià)為1/2MaxOD所對(duì)應(yīng)的血清的稀釋倍數(shù)，因此1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)小鼠的血清效價(jià)分別為1∶100 000、1∶100 000、5∶100 000，3只小鼠對(duì)抗原的反應(yīng)性都較高。

最終選擇1號(hào)小鼠取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。融合后第8天觀察融合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第10天對(duì)其進(jìn)行高通量ELISA篩選，獲得陽性信號(hào)較強(qiáng)且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞4 株，將確定的4個(gè)強(qiáng)陽性孔中的細(xì)胞挑出至新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，然后經(jīng)過24孔板、6孔板的放大培養(yǎng)和HAT、HT選擇性培養(yǎng)基的篩選后進(jìn)行亞克隆，每個(gè)亞克隆挑選出長(zhǎng)勢(shì)旺盛、抗體分泌相對(duì)多的細(xì)胞株各1個(gè)，并命名為TE1-1、TE2-1、TE3-1和TE4-1。將獲得的4株細(xì)胞用轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)10～14 d，細(xì)胞凋亡達(dá)到90%，此時(shí)抗體分泌量最大，收集細(xì)胞上清液，再利用蛋白A純化后，獲得4 株單克隆抗體。

2.2特異性抗體的獲得及鑒定

2.2.1單克隆抗體的 SDS-PAGE 鑒定 獲得的TE1-1、TE2-1、TE3-1和TE4-1抗體通過 SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示在抗體輕鏈與重鏈的位置，即25 kD和50 kD處都有一條清晰可見的條帶。沒有明顯雜帶出現(xiàn)，可以判斷獲得抗體的純度基本都在 95%以上。

2.2.2抗體效價(jià)測(cè)定 包被抗原TMV-EPMK-μE3，包被液為pH=9.5的碳酸鹽緩沖液，抗原濃度0.5 μg/ml，上樣抗體 4 倍梯度稀釋，獲得抗體效價(jià)如圖3所示，TE3-1和TE4-1抗體效價(jià)為 105K∶4，最低檢測(cè)限約為5 ng，TE1和TE2抗體效價(jià)為105 000∶1.5，最低檢測(cè)限約為 1 ng。結(jié)果表明植物病毒作為半抗原的載體可以制備出高親和力的單克隆抗體。

圖1 TMV-EPMK-μE3第三次免疫小鼠后的效價(jià)Fig.1 Titer after third TMV-EPMK-μE3 immunization in mice

2.2.3抗體的亞型鑒定 在實(shí)驗(yàn)中均采用蛋白A柱對(duì)抗體進(jìn)行純化，IgM與IgG1在低鹽條件下不結(jié)合或弱結(jié)合蛋白A柱 ，因此所獲得的抗體亞型應(yīng)為IgG2a、IgG2b或IgG3等重鏈類型。通過對(duì)亞克隆后的4株抗體亞型的鑒定，TE1-1和TE3-1單抗重鏈為IgG2b；TE2-1和TE4-1單抗重鏈為IgG2a，輕鏈類型均為 κ(表2)。

2.2.44株抗體的特異性鑒定 通過包被 CPMV-μE3、TMV-EPMK-μE3和 TMV-EPMK和水，對(duì) TMV-EPMK-μE3免疫獲得的單克隆抗體進(jìn)行 ELISA特異性檢測(cè)，結(jié)果見圖4，TE2-1和TE4-1不與CPMV-μE3發(fā)生反應(yīng)，而與TMV-EPMK-μE3和TMV-EPMK產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原抗體反應(yīng)，說明TE2-1和TE4-1是針對(duì)TMV-EPMK的抗體；TE1-1 和TE3-1不與TMV-EPMK 發(fā)生反應(yīng)，而與TMV-EPMK-μE3和CPMV-μE3發(fā)生較強(qiáng)的抗原抗體反應(yīng)，說明TE1-1 和TE3-1不與載體產(chǎn)生交叉反應(yīng)，是 μE3的特異性抗體。

圖2 TE1-1、TE2-1、TE3-1和TE4-1 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of TE1-1，TE2-1，TE3-1 and TE4-1Note: 1.Marker;2.TE1-1;3.TE2-1;4.TE3-1;5.TE4-1.

圖3 TMV-EPMK-μE3 4株單克隆抗體效價(jià)測(cè)定Fig.3 Titration ELISA for anti-TMV-EPMK-μE3 mAbs

表2 單克隆抗體的亞型鑒定

Tab.2 Subtypes identification of monoclonal antibodies

No.The type of light chainThe type of heavy chainTE1-1κIgG2bTE2-1κIgG2aTE3-1κIgG2bTE4-1κIgG2a

圖4 TMV-EPMK-μE3免疫小鼠獲得單克隆抗體的特異性分析Fig.4 Specificity analysis of mAbs against TMV-EPMK-μE3

3 討論

TMV 有一個(gè)簡(jiǎn)單的由單個(gè)外殼蛋白纏繞的6.4 kB(+)-單鏈 RNA 功能結(jié)構(gòu)，其為RNA病毒，并且能夠?qū)ζ溥M(jìn)行簡(jiǎn)單的基因操控。TMV能夠使植物感染，但最近研究表明，通過基因改造或化學(xué)修飾后其可以應(yīng)用于疫苗的研發(fā)中。在疫苗的研發(fā)中，抗原可以通過TMV 作為載體遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，進(jìn)而刺激機(jī)體完成較強(qiáng)免疫應(yīng)答[11]。

μE3作為半抗原，不具備免疫原性，無法單獨(dú)刺激機(jī)體并引起有效的免疫應(yīng)答，把半抗原與通過化學(xué)方法或基因改造的分子載體 (Protein carrier) 結(jié)合，使半抗原成為該蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇，該半抗原就會(huì)獲得免疫原性，并且能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[12-15]。在本實(shí)驗(yàn)中TMV作為半抗原μE3的載體，利用通過化學(xué)連接形成的TMV-EPMK-μE3復(fù)合體來免疫小鼠，再通過高效高通量單抗雜交瘤篩選技術(shù)獲得了針對(duì) μE3的2株單克隆抗體，對(duì)抗體純度、特性及抗原抗體反應(yīng)性均作了分析，實(shí)驗(yàn)獲得的高親和力的 針對(duì)μE3的單克隆抗體可以檢測(cè)母體血液和尿液中的μE3濃度，從而判斷胎兒的健康和發(fā)育狀況，對(duì)能夠引起胎兒畸形的愛德華氏綜合征或唐氏綜合征進(jìn)行產(chǎn)前篩查[16]。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，半抗原μE3利用TMV作為載體，使其免疫原性獲得了有效提高，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體不產(chǎn)生毒性反應(yīng)。將來還需要測(cè)試不同的結(jié)構(gòu)特征的半抗原或抗原與植物病毒納米粒子載體還需做進(jìn)一步的測(cè)試研究。此外，進(jìn)一步深入研究納米粒子形狀為基礎(chǔ)的抗原載體在動(dòng)物體內(nèi)是如何影響免疫應(yīng)答的機(jī)理的也是非常重要的。