徐麗慧 裘春寧 董曉勤 金優(yōu)萍 王賢軍 吳盛海

HPV感染可引起皮膚或黏膜良性或惡性病變，約有5%的腫瘤與HPV感染有關(guān)[1]。HPV有200多種亞型，根據(jù)感染HPV后引起后果的嚴(yán)重程度分為高危型和低危型，低危型HPV與尖銳濕疣及呼吸道中的多發(fā)性乳頭瘤相關(guān)，高危型HPV感染可導(dǎo)致癌變，包括宮頸及口咽部等的癌變[2]。宮頸癌是引起女性癌癥死亡的第三大癌癥[3]，如果在發(fā)病早期能夠明確診斷，約90%的宮頸癌可以治愈。廣泛開展HPV篩查及進(jìn)行HPV多價疫苗注射是有效的預(yù)防手段[4]。我國不同地區(qū)女性人群受感染的HPV亞型分布不盡相同[5]。本研究以浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院2015—2020年婦科門診患者與健康體檢者為調(diào)查對象，了解HPV感染現(xiàn)狀及變化趨勢，以期為推廣合適的HPV篩查策略和疫苗防治提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015—2020年在本院首次就診的49 766例婦科門診患者和12 342位女性健康體檢者為研究對象，平均年齡分別為（38.50±11.33）歲和（43.25±11.23）歲，均行宮頸HPV篩查。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 YN-H16恒溫雜交儀，宮頸脫落細(xì)胞采集器及HPV基因分型（23型）檢測試劑盒均由深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供。

1.2.2 檢測方法 采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交法。（1）樣本采集：采用窺陰器暴露宮頸口，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物拭去。取出宮頸刷置于宮頸口，單方向緩緩旋轉(zhuǎn)4～5周以獲得足量的上皮細(xì)胞；將刷頭放入裝有宮頸脫落細(xì)胞保存液的洗脫管中，立即送檢。樣本室溫保存不超過12 h，4℃保存不超過7 d。（2）HPV DNA提?。撼浞窒疵搶m頸刷并將洗脫液全部轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，13 000 r/min 離心 10 min，棄上清液；加入 50 μl裂解液懸浮沉淀，沸水浴加熱10 min；13 000 r/min離心 10 min，留取上清液備用。（3）PCR 擴(kuò)增：20 μl反應(yīng)液加5 μl已提取的待測樣本DNA，按照下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃ 15 min；90 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s、42 ℃ 90 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 延伸5min。（4）雜交及顯色：15 ml離心管中加入標(biāo)記編號的膜條，6 ml A液（0.03 mol/L檸檬酸鈉）以及相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，沸水浴加熱10 min，51℃雜交1.5 h，取出膜條，置于預(yù)熱的B液（0.0075 mol/L檸檬酸鈉）51℃洗滌5 min后，將膜條置于顯色液中避光顯色30 min。（5）結(jié)果判讀：根據(jù)膜條上藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)的位置，讀取相應(yīng)位置上標(biāo)注的基因型信息。僅1個基因型位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為相應(yīng)基因型的單一感染；多個基因型位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，則為相應(yīng)基因型的混合感染。共檢測23種HPV基因型，根據(jù)致病性不同分為：高危型共17種，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73 和 82；低危型共 6 種，包括 HPV 6、11、42、43、81 和 83。（6）質(zhì)量控制：陰性質(zhì)控品的雜交膜條除IC位點(diǎn)有藍(lán)色斑點(diǎn)外均不顯色，陽性質(zhì)控品必須在相應(yīng)的HPV基因型位點(diǎn)及IC位點(diǎn)顯色，否則試驗(yàn)失敗。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 婦科門診患者與健康體檢者HPV感染率比較及年度變化 婦科門診患者HPV感染率高于健康體檢者（P＜0.05）。無論是婦科門診患者還是健康體檢者，HPV感染率 2018—2020年較 2015—2017年下降（P＜0.05）。婦科門診患者HPV多重感染率也高于健康體檢者（P＜0.05），健康體檢者的HPV多重感染率2018—2020年較 2015—2017年下降（P＜0.05），但婦科門診患者HPV多重感染率2018—2020年與2015—2017年比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 婦科門診患者與健康體檢者感染HPV亞型分布情況及年度變化 無論是婦科門診患者還是健康體檢者，單一HPV感染中，52亞型占比最高，分別為18.69%和18.62%。婦科門診患者單一亞型感染占比較高的還有16亞型（10.59%），58亞型（8.46%），53亞型（7.05%），81亞型（6.82%）。健康體檢者單一亞型感染占比較高的還有81亞型（10.22%），53亞型（9.35%），58亞型（9.03%），16亞型（7.37%）。其中婦科門診患者16亞型及健康體檢者51亞型占比2018—2020年較2015—2017年明顯降低（P＜0.05）。2種亞型感染中，婦科門診患者以16亞型和52亞型混合感染為主（2.80%），健康體檢者以52亞型和81亞型混合感染為主（4.55%）。除了健康體檢者33亞型和58亞型混合感染2018—2020年（P＜0.05）外，其余兩組人群的多重感染年度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 不同年齡段婦科門診患者與健康體檢者HPV高危亞型感染情況 婦科門診患者中，HPV高危亞型感染率的年齡分布變化呈現(xiàn)兩個峰谷，兩個峰值年齡分別為＜20歲（44.28%）和60～歲（31.35%）。對應(yīng)的谷值年齡分別為30～歲（17.75%）和＞70歲（20.00%）。且婦科門診30～歲、40～歲和50～歲患者2018—2020年HPV高危亞型感染率較2015—2017年明顯下降（P＜0.05）。同樣，健康體檢者HPV高危亞型感染率的年齡分布也同樣為兩個峰谷，其中60～歲者HPV高危亞型感染陽性率最高（14.92%），＞70歲者最低者（3.01%）；20～歲、30～歲和40～歲者HPV高危亞型感染率2018—2020年較2015—2017 年明顯下降（均 P＜0.05），而 50～歲、60～歲和＞70歲者HPV高危亞型感染率年度變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

3 討論

HPV高危亞型持續(xù)性感染是宮頸癌的主要致病因素之一，HPV檢測及疫苗注射是有效的早期預(yù)防宮頸癌手段[4]。本研究回顧分析了2015—2020年本院婦科門診患者和健康體檢者HPV感染情況，婦科門診患者HPV感染陽性率為23.97%，其中約1/4患者為多重HPV亞型感染。雖然健康體檢者HPV感染陽性率低于婦科門診患者，但也達(dá)到了13.23%。相似的約1/4患者為多重HPV亞型感染。本研究結(jié)果表明，杭州地區(qū)婦科門診患者HPV感染陽性率要高于北京地區(qū)（2015—2016年）的 19.0%[6]和深圳地區(qū)（2014—2016年）的11.02%[5]。HPV感染陽性率高低主要與初次性生活的年齡、性行為習(xí)慣、性伴侶數(shù)、吸煙、長期口服避孕藥及免疫缺陷與抑制等有關(guān)[7]。本研究回顧分析的婦科門診患者中，相對于其他年齡段患者，＜20歲的人群高危亞型HPV感染率最高，值得引起社會和醫(yī)生關(guān)注。

表1 2015—2020年婦科門診患者與健康體檢者的HPV感染情況[例（%）]

表2 2015—2020年婦科門診患者與健康體檢者感染HPV亞型分布情況

表3 不同年齡段婦科門診患者與健康體檢者HPV高危亞型感染情況（%）

無論是婦科門診患者還是健康體檢者，＜20歲和60～歲年齡人群高危亞型HPV感染率高于平均水平，而30～歲和40～歲人群高危亞型HPV感染陽性率低于平均水平，與文獻(xiàn)報(bào)道有一定差異[8]。由于不同年齡段人群的性生活活躍度、宮頸局部免疫易感或免疫自我清除狀態(tài)不同，HPV感染陽性率亦不同。＜20歲的人群由于生活工作尚不穩(wěn)定，且性生活不規(guī)律，可能出現(xiàn)感染的高峰，而對于絕經(jīng)后女性，由于生殖道局部免疫力下降，影響了免疫清除病毒能力，導(dǎo)致高危亞型HPV感染陽性率隨著年齡的增大而逐漸上升，本研究也發(fā)現(xiàn)婦科門診患者中60歲以上人群的HPV高危亞型感染率以及健康體檢者50歲以上人群的HPV高危亞型感染率在2015—2020年的前3年和后3年的波動無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示了50歲以上人群存在持續(xù)HPV高危亞型感染。持續(xù)高危亞型HPV感染是宮頸癌前病變和宮頸浸潤癌發(fā)生的必要條件[9]，因此不可忽視對絕經(jīng)后女性早期宮頸癌的篩查。加拿大的研究數(shù)據(jù)表明宮頸癌篩查應(yīng)一直持續(xù)到75歲才可能降低宮頸癌發(fā)生風(fēng)險[10]。

對HPV感染亞型的分析發(fā)現(xiàn)，婦科門診患者和健康體檢者感染高危型HPV亞型為52、16、58、53和51，低危HPV亞型主要是81。有研究表明HPV高危亞型感染是引起宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的主要病因[11]。但相關(guān)研究提示，除HPV 16型外，中國等亞洲國家中與宮頸病變相關(guān)性較高、致病性較高的HPV亞型可能與其他國家有所不同，具有一定的特殊性[6]。國內(nèi)有研究對267例CINⅡ+患者進(jìn)行HPV分型檢測后發(fā)現(xiàn)，與CINⅡ+最相關(guān)的亞型是HPV 16、52和58型[12]，本研究數(shù)據(jù)顯示這3種亞型感染在門診患者中為前3名HPV亞型，且無論是婦科門診患者還是健康體檢者，單一HPV感染52亞型占比均高于18%。且2種亞型感染中，婦科門診患者以16亞型和52亞型混合感染為主，占比達(dá)到2.80%。需要引起重視的是，目前國內(nèi)的預(yù)防性HPV疫苗二價、四價分別覆蓋 16、18型和 6、11、16、18型，而不能完全覆蓋國內(nèi)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示優(yōu)勢高危亞型：52、58、53和51型，而九價疫苗在四價基礎(chǔ)上增加31、33、45、52和58型，對于國人會是更好的選擇。本研究結(jié)果與深圳地區(qū)的數(shù)據(jù)相似，而與其他地區(qū)有所差別[5]。

綜上所述，杭州地區(qū)婦科門診患者和健康體檢者HPV 感染以高危亞型 52、16、58、53、51 及低危亞型 81型為主，且多重感染以高危型52型為主，目前九價疫苗能更好覆蓋杭州地區(qū)人群常見的HPV亞型。婦科門診患者和健康體檢者HPV高危亞型感染率均呈現(xiàn)隨年齡呈現(xiàn)先下降再上升再下降的變化，且門診患者中＜20歲的患者及60歲以上患者和健康體檢者中50～70歲人群具有持續(xù)高水平的HPV高危亞型感染率，應(yīng)引起更多關(guān)注。