朱靜 潘志文 陳勇毅 徐笑紅

近年來(lái)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。2018年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)（LOBOCAN2018）表明，全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)約185萬(wàn)，發(fā)病率居第3位，占比10.2%；年死亡人數(shù)超過(guò)88萬(wàn)，死亡率居第2位，占比9.2%[2]。在我國(guó)，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別居第3位和第5位[3]。隨著靶向治療藥物表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑西妥昔單抗（Cetuximab）的問(wèn)世，結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入了靶向治療時(shí)代[4]。KRAS基因是人體腫瘤中常見(jiàn)的致癌基因。據(jù)報(bào)道，結(jié)直腸癌患者中KRAS基因的突變率約為27%～43%[5]，常見(jiàn)突變位點(diǎn)位于2號(hào)外顯子的12號(hào)和13號(hào)密碼子，突變類型主要為G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C[6]。抗 EGFR 治療只有對(duì)野生型KRAS基因的患者才有效，對(duì)于突變型的患者則無(wú)效[7]。因此，KRAS基因突變狀態(tài)檢測(cè)在結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療中具有重要意義。

手術(shù)和腸鏡活檢獲得的結(jié)直腸癌組織是檢測(cè)突變的最佳樣本，但部分中晚期患者難以取材，檢測(cè)外周血中的游離腫瘤DNA是否突變成為新趨勢(shì)[8]。本研究選取357例結(jié)直腸癌住院患者的腫瘤組織及外周血樣本，配對(duì)檢測(cè)KRAS基因突變情況，以基因測(cè)序作為金標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證兩種標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的符合率，以期為結(jié)直腸癌外周血標(biāo)本檢測(cè)KRAS基因突變提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年2月至2018年10月于浙江省腫瘤醫(yī)院就診的357例結(jié)直腸癌患者，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，其中男204例，女153例，年齡20～91（65.62±12.61）歲；包括結(jié)腸癌82例，直腸癌275例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的177例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的180例。收集患者術(shù)中組織樣本，經(jīng)石蠟包埋，置于-80℃保存；配對(duì)收集EDTA-K2抗凝的外周血樣本，3 000 r/min離心5 min，分離血漿1 ml，置于4℃保存。

1.2 儀器和試劑 人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒購(gòu)于為真生物醫(yī)藥科技有限公司（批號(hào)：3400362）；組織樣本DNA提取試劑盒和血液樣本DNA提取試劑盒均購(gòu)于QIAGEN 公司（批號(hào)：56404、51104）；BigDye?Terminator測(cè)序試劑盒購(gòu)于ABI公司（批號(hào)：4336697）。LightCyclerTM480實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀為Roche公司產(chǎn)品；ABI 3730測(cè)序儀為蘇州金唯智生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法 以突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）為主，融合了熔解曲線分析，利用ARMS突變特異性引物對(duì)突變靶序列進(jìn)行高精準(zhǔn)PCR擴(kuò)增。

1.3.1 DNA提取 按QIAGEN公司組織或血液DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行。

1.3.2 PCR檢測(cè) 按照人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒所述方法，將 2×MicroDiag Mutation Detection Mix、陽(yáng)性質(zhì)控品、純化水以及稀釋成同一濃度的待測(cè)組織樣本基因組DNA或外周血游離DNA插入冰盒中，恢復(fù)至室溫。將DNA聚合酶快速離心后置于冰上。其中MicroDiag Mutation Detection Mix（30人份）的組成為 0.5～1 μmol/L 引物、0.2～0.5 μmol/L 阻滯劑、0.5～1 mmol/L dNTP、5 mmol/L MgCl2、36 μl EvaGreen、100 mmol/L KCl及純化水。針對(duì)7個(gè)突變位點(diǎn)，使用Oligo軟件設(shè)計(jì)的引物見(jiàn)表1，由Invitrogen公司合成。反應(yīng)體系中各種成分見(jiàn)表2，每個(gè)總反應(yīng)體積為20 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.3.3 金標(biāo)準(zhǔn)的確立 本研究以基因測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)。組織樣本提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)KRAS基因突變情況。測(cè)序引物使用Oligo軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。引物序列如下：上游5′-ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3′； 下 游 5′-CAGTAATATGCATATTAAAACAAGA-3′。

表1 KRAS基因引物序列

表2 反應(yīng)體系的各成分

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用四格表統(tǒng)計(jì)法，分別統(tǒng)計(jì)腫瘤組織與外周血標(biāo)本的陰、陽(yáng)性樣本數(shù)，列成2×2列聯(lián)表，計(jì)算兩種方法的符合率，并以測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算Kappa值，見(jiàn)表3。

表3 腫瘤組織樣本與外周血樣本PCR檢測(cè)結(jié)果比較

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況

2.1.1 腫瘤組織PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果符合情況 腫瘤組織PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的陽(yáng)性符合率為 96.13%（95%CI：91.76%～98.57%）；陰性符合率93.56%（95%CI：89.25%～96.53%）；總符合率 94.68%（95%CI：91.81%～96.77%）。Kappa 值為 0.8922（95%CI：0.8451～0.9394），說(shuō)明兩種方法存在高度一致性。腫瘤組織PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況見(jiàn)表4。

表4 腫瘤組織PCR檢測(cè)與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況（例）

2.1.2 外周血PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況 外周血檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的陽(yáng)性符合率63.23%（95%CI：55.12%～70.82%）；陰性符合率 84.16%（95%CI：78.38%～88.91%）；總符合率 75.07%（95%CI：70.25%～79.47%）。Kappa 值為 0.4829（95%CI：0.3914～0.5744），說(shuō)明兩種方法存在高度一致性。外周血PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果比較見(jiàn)表5。

表5 外周血PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況（例）

2.1.3 腫瘤組織與外周血PCR檢測(cè)結(jié)果的符合情況腫瘤組織與外周血PCR檢測(cè)陽(yáng)性符合率為62.35%（95%CI：54.40%～69.83%），陰性符合率85.13%（95%CI：79.34%～89.81%），總符合率 74.79%（95%CI：69.95%～79.21%）。Kappa 值為 0.4828（95%CI：0.3923～0.5733），說(shuō)明兩種方法存在一致性，且一致性較高。腫瘤組織與外周血PCR檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表6。

表6 腫瘤組織與外周血PCR檢測(cè)結(jié)果的符合情況（例）

2.2 各基因突變位點(diǎn)PCR檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況 基因測(cè)序陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)為157（155例患者），腫瘤組織PCR檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)147，與基因測(cè)序符合率93.63%；外周血檢測(cè)陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)85，與基因測(cè)序符合率為54.14%，見(jiàn)表7。

表7 各基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果的符合情況[例（%）]

2.3 各基因突變位點(diǎn)陽(yáng)性結(jié)果數(shù)量比較 基因測(cè)序結(jié)果 G13D（32.48%）、G12D（31.85%）突變比例最高，G12R（2.55%）突變比例最低；腫瘤組織PCR檢測(cè)結(jié)果G12D（31.21%）突變比例最高，與基因測(cè)序符合率為98.00%，G12R（2.55%）突變比例最低，與基因測(cè)序符合率為100%。外周血檢測(cè)結(jié)果G12D（20.38%）突變比例最高，與基因測(cè)序符合率為64.00%，G12R（1.27%）突變比例最低，與基因測(cè)序符合率為50%。各基因突變位點(diǎn)陽(yáng)性結(jié)果數(shù)量見(jiàn)表8。

表8 各基因突變類型陽(yáng)性結(jié)果數(shù)量（例）

3 討論

腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，KRAS基因是EGFR依賴的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Ras-Raf-MAPK途徑的重要基因[9]。美國(guó)國(guó)家癌癥綜合治療聯(lián)盟（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）頒布的《結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》明確指出：所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都應(yīng)檢測(cè)KRAS基因狀態(tài)，只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑（如愛(ài)必妥和帕尼單抗）治療[10]。

研究發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變?yōu)槟[瘤特異性的體細(xì)胞遺傳改變，目前未在正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而且腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，常有少量腫瘤細(xì)胞從原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血[11]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并釋放出遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致血中存在游離腫瘤DNA，與原發(fā)腫瘤遺傳信息相同[12]。所以，若原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞存在KRAS基因突變，即可從外周血游離DNA中檢測(cè)出來(lái)。而且，外周血采集方便，創(chuàng)傷較小，患者容易接受。因此，突變檢測(cè)的樣本選擇除了結(jié)直腸癌組織外，外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）已逐漸成為替代樣本來(lái)源。ctDNA主要來(lái)自腫瘤細(xì)胞自主分泌、壞死和凋亡后DNA片段，其片段上往往攜帶突變信息。對(duì)于難以獲得結(jié)直腸癌組織或耐藥突變?nèi)巳海琧tDNA片段上KRAS突變檢測(cè)有重要的臨床意義[13]。

本研究采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)結(jié)合熔解曲線分析，利用阻滯劑與特異性引物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合野生型模板，使野生型背景DNA不被擴(kuò)增；通過(guò)EvaGreen染料收集突變擴(kuò)增信號(hào)和熔解信號(hào)；利用熔解曲線分析區(qū)分非特異性擴(kuò)增片段，從而進(jìn)一步提高熒光PCR檢測(cè)的靈敏度和特異度。實(shí)驗(yàn)以基因測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，該技術(shù)是WHO推出的基因檢測(cè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所檢測(cè)基因區(qū)段的每個(gè)核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確率高達(dá)99.99%。為本次實(shí)驗(yàn)的客觀性提供了保障。

組織檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果比較，兩種方法存在一致性，且一致性較高。本研究共計(jì)19例不符，其中6例基因測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性，組織檢測(cè)結(jié)果為陰性，可能由于PCR反應(yīng)過(guò)程中樣本與引物結(jié)合受到干擾，導(dǎo)致與測(cè)序結(jié)果不符；13例測(cè)序結(jié)果為陰性，組織檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，考慮試劑盒所采用的PCR檢測(cè)方法學(xué)靈敏度優(yōu)于測(cè)序方法學(xué)所致，此點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

外周血檢測(cè)結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果比較，兩種方法也存在一致性。本研究共計(jì)89例不符，其中有57例基因測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性，外周血檢測(cè)結(jié)果為陰性，可能與外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA含量較低有關(guān)，血液中游離DNA少，突變的游離DNA更少，當(dāng)KRAS基因突變量低于試劑盒的最低檢測(cè)限，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率降低；另外32例基因測(cè)序結(jié)果為陰性，外周血檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，由于腫瘤病灶非均質(zhì)化，用于受檢部分的組織樣本可能不攜帶KRAS基因突變，而腫瘤其它部分組織塊含有KRAS基因突變，外周血循環(huán)DNA來(lái)自腫瘤原發(fā)灶，因此導(dǎo)致外周血檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

腫瘤組織與外周血的檢測(cè)結(jié)果比較，兩種方法存在一致性，且一致性較高。本研究共計(jì)90例不符，其中有61例組織檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，外周血檢測(cè)結(jié)果為陰性，同樣可能由于外周血中的KRAS基因突變量低于試劑盒的最低檢測(cè)限所致；另有29例組織檢測(cè)結(jié)果為陰性，外周血檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，同樣可能與腫瘤病灶非均質(zhì)化有關(guān)。

對(duì)各突變類別檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，無(wú)論采用何種檢測(cè)方法，基因突變率較高的是G13D、G12D、G12V；較低的是G12A、G12S、G12R、G12C，各方法學(xué)的檢測(cè)結(jié)果一致性較高。

根據(jù)以上研究結(jié)果，該KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒可較好地反應(yīng)結(jié)直腸癌患者組織及外周血樣本中KRAS基因突變情況。為靜脈血代替腫瘤組織檢測(cè)KRAS基因突變提供了有力依據(jù)。