辛苗 張春光 于京福 代汭 萬效梅 王燕 王曉

胸外科手術(shù)通過雙腔氣管實現(xiàn)的單肺通氣（OLV）會導(dǎo)致通氣血流比值失調(diào)、肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而造成肺間質(zhì)和肺泡水腫，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫，其發(fā)展到嚴(yán)重階段稱為急性呼吸窘迫綜合征[1]。OLV引發(fā)急性肺損傷的機(jī)制包括中性粒細(xì)胞的活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和T細(xì)胞失衡[2]，如何減輕OLV引起的肺損傷是當(dāng)今臨床醫(yī)生研究的熱點問題。右美托咪定是一種高度選擇性α2受體激動劑，可用于ICU患者短期和長期鎮(zhèn)靜[3]。有研究表明，右美托咪定可減輕膿毒癥引起的急性肺損傷[4]。但在目前關(guān)于右美托咪定改善OLV引起肺損傷的研究多為小樣本、單中心研究，缺乏臨床研究的內(nèi)部真實性。細(xì)胞焦亡是組織程序性壞死的另一種形式，可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞的模式識別受體（PRRs）激活，也可以誘導(dǎo)刺激炎癥反應(yīng)[5]。有研究表明右美托咪定減輕大鼠離體肺缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與抑制細(xì)胞焦亡有關(guān)[6]，目前只局限于動物研究；右美托咪定是否通過細(xì)胞焦亡機(jī)制減輕肺葉切除術(shù)患者OLV引起的急性肺損傷，國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究。本研究擬評價右美托咪定對肺葉切除術(shù)患者肺組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡相關(guān)因子的影響，進(jìn)一步明確右美托咪定減輕肺損傷的作用機(jī)制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年11月至2019年11月青島大學(xué)附屬醫(yī)院210例、青島市市立醫(yī)院228例需行胸腔鏡肺葉切除術(shù)患者共438例，男221例，女217例，ASA分級Ⅰ 或Ⅱ級，年齡30～70歲，體重50～80 kg。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組（C組）和右美托咪定組（D組），每組219例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）心力衰竭分級（NYHA分級）Ⅰ或Ⅱ級；（2）無腦外傷、腦出血、腦梗死病史；（3）肝腎功能正常；（4）近期無酗酒濫用藥物史；（5）既往無精神心理疾病病史，且近期未服用抗精神病藥物；（6）手術(shù)時間120～180 min；（7）患者知情且愿意配合試驗。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）NYHA 分級Ⅲ～Ⅳ級；（2） 術(shù)前肺功能嚴(yán)重下降（PaO2＜60 mmHg或用力呼氣量＜50%）；（3）凝血功能異?；蜓“鍦p少；（4）既往曾接受放療、化療或免疫治療；（5）全身或局部感染（包括C反應(yīng)蛋白升高、白細(xì)胞增多或體溫＞38℃）；（6）患者中途拒絕繼續(xù)配合試驗或者死亡；（7）圍術(shù)期發(fā)生嚴(yán)重的不良事件，如心律失常、氣道插管困難、過敏性休克等。C組手術(shù)暫停7例，不同意參與本研究5例，術(shù)中出現(xiàn)大出血8例惡性心律失常4例，術(shù)后1 d心臟停搏2例，最終納入193例。D組手術(shù)暫停5例，不同意參與本研究4例，術(shù)中出現(xiàn)大出血8例、惡性心律失常9例，術(shù)后1 d體溫＞38℃3例，最終納入190例。兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表l。本研究經(jīng)青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均提供書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 患者入手術(shù)室后開放動靜脈，連接心電監(jiān)護(hù)。D組于麻醉誘導(dǎo)前10 min經(jīng)靜脈輸注右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）負(fù)荷劑量1.0 μg/kg，隨后以0.3 μg/（kg·h）的速率靜脈輸注至術(shù)畢前30 min，C組以同樣方式靜脈輸注等容量0.9%氯化鈉注射液。麻醉誘導(dǎo)采用靶控輸注異丙酚，初始濃度1.0 μg/ml，逐步增加到 0.3 μg/ml，直到腦電雙頻指數(shù)（BIS）值 40～55，靜脈注射咪達(dá)唑侖0.03 ml/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg和羅庫溴銨0.9 mg/kg。麻醉誘導(dǎo)后行雙腔氣管導(dǎo)管插管術(shù)，采用纖維支氣管鏡確定雙腔氣管導(dǎo)管位置，氣管插管完成后，潮氣量8 ml/kg，吸氣與呼氣比為1∶2，呼吸頻率為8次/min。持續(xù)輸注丙泊酚4～8 mg/（kg·h）、瑞芬太尼0.1～0.2 μg/（kg·min）和順阿曲庫銨0.3～0.4 mg/kg維持麻醉，維持BIS值40～60。手術(shù)前將通氣模式改為OLV，調(diào)整呼吸頻率和潮氣量以維持脈搏血氧飽和度和呼吸末二氧化碳分壓?；颊呋謴?fù)自主呼吸拔管后進(jìn)入麻醉后監(jiān)護(hù)病房（PACU），Steward評分＞4后離開PACU。術(shù)中應(yīng)保持患者血流動力學(xué)穩(wěn)定，術(shù)畢均連接13960自控鎮(zhèn)痛泵（美國Abbott公司）行靜脈自控鎮(zhèn)痛（PCIA），維持靜態(tài)視覺模擬評分法（VAS）＜3分，鎮(zhèn)痛藥配方：酒石酸布托啡諾注射液10 mg，用0.9%氯化鈉注射液稀釋到100 ml，負(fù)荷量為2 ml，背景輸注速率為2 ml/h，PCIA劑量為0.5 ml，鎖定時間為15 min。

表1 兩組患者一般資料的比較

在麻醉的影響下，平均動脈壓（MAP）低于基線20%或MAP＜60 mmHg持續(xù)超過30 s為低血壓，予去氧腎上腺素40 μg。靜脈注射阿托品0.3 mg治療心動過緩（心率＜60次/min）。

1.2.2 肺組織采集及測定 術(shù)中距離病變區(qū)8 cm以上獲取4 mm×4 mm×4 mm肺組織標(biāo)本3份，-80℃冰箱保存，采用Western blot法檢測肺組織消皮素D（GSDMD）、NOD 樣受體家族蛋白 3（NLRP3）、凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（Caspase-1）的表達(dá)。取1份肺組織標(biāo)本按照每20 mg組織加200 μl裂解液，超聲裂解，4℃離心后取上清液，12 000 r/min 3～5 min，BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100℃變性5 min，-20℃凍存電泳完畢將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜（美國Millipore公司）上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，取出膜，于搖床上用TBST洗膜5 min×3次。孵育袋中加入封閉液稀釋的兔GSDMD多克隆抗體（稀釋度 1∶1 000，英國 Biorbyt公司）、兔 NLRP3多克隆抗體（稀釋度 1∶1 000，英國 Biorbyt公司）、兔 ASC 多克隆抗體（稀釋度 1∶800，美國 Santa Cruz公司）、兔 Caspase-1多克隆抗體（稀釋度1∶1 000，英國 Biorbyt公司）、β-actin（稀釋度 1∶2 000，美國 Santa Cruz公司），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度1∶2 000，美國Jackson公司）室溫孵育2 h。TBST洗膜15 min×5次。膜于化學(xué)發(fā)光檢測試劑（試劑A∶試劑 B=1∶1）反應(yīng) 2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中用X線膠片感光、顯影、定影。采用凝膠圖像Image J軟件（美國NIH公司）分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參βactin條帶灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

另選1份肺組織稱濕重（W）后，將肺組織在電烤箱中以70℃烘烤至恒重，稱干重（D），并計算肺組織的干濕重（W/D）值。另1份肺組織經(jīng)HE染色后用BX41型顯微鏡（日本Olympus公司）觀察，參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行肺組織病理學(xué)損傷評分。

1.3 觀察指標(biāo) （1）記錄患者手術(shù)過程中出血量（從手術(shù)切口到皮膚閉合）、手術(shù)時間（從手術(shù)切口到皮膚閉合）、OLV 時間。（2）分別于開始 OLV 即刻（T1）、15 min（T2）、30 min（T3）、60 min（T4）和恢復(fù)雙肺通氣 1 h（T5）采集動脈血2 ml進(jìn)行血?dú)夥治霾⒂嬎阊鹾现笖?shù)（OI），OI=PaO2/吸入氧濃度（FiO2）。（3）術(shù)后情況：記錄術(shù)后 48 h 內(nèi)兩組患者肺炎、肺不張的發(fā)生情況，記錄術(shù)后住院時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者不同時點OI的比較 與 T1時比較，兩組患者 T2～5時 OI均降低（均 P＜0.05）；與 C 組比較，D組 T2～5時 OI升高（P＜0.05），見表 2。

表2 兩組患者不同時點OI的比較

2.2 兩組患者肺組織病理觀察比較 光鏡下，C組肺組織炎性細(xì)胞浸潤、肺泡壁增厚、充血明顯。肺泡內(nèi)可見較多粉紅色、均勻的水腫液，見圖 1。D組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)滲出較少，見圖2。

圖2 D組肺組織病理檢查所見（HE染色，×400）

2.3 兩組患者肺組織W/D值和肺病理學(xué)損傷評分的比較 與C組比較，D組肺組織W/D值降低（P＜0.05），肺病理學(xué)損傷評分降低（P＜0.05），見表3。

2.4 兩組患者肺組織GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)的比較 與C組比較，D組肺組織GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase1的表達(dá)均降低（P＜0.05），見表4和圖3。

表3 兩組患者肺組織W/D值和肺病理學(xué)損傷評分的比較

表4 兩組患者肺組織GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)的比較

圖3 兩組患者肺組織消皮素D（GSDMD）、NOD樣受體家族蛋白3（NLRP3）、凋亡相關(guān)微粒蛋白（ASC）和半胱天冬梅 -1（Caspase-1）表達(dá)電泳圖

2.5 兩組患者術(shù)后肺炎、肺不張、呼吸衰竭發(fā)生率及術(shù)后住院時間的比較 與C組比較，D組術(shù)后肺炎和肺不張發(fā)生率降低，術(shù)后住院時間明顯縮短（均P＜0.05），兩組患者術(shù)后均未見呼吸衰竭發(fā)生。見表5。

表5 兩組患者術(shù)后肺炎、肺不張、呼吸衰竭發(fā)生率及術(shù)后住院時間的比較

3 討論

肺切除手術(shù)可引起術(shù)后肺部并發(fā)癥包括肺不張、肺炎和急性呼吸窘迫綜合征。呼吸機(jī)引起的肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是肺切除術(shù)后高發(fā)病率和高死亡率的主要原因[8]。隨著微創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用，OLV已成為胸腔內(nèi)手術(shù)必須的操作手段，有研究發(fā)現(xiàn)，OLV與術(shù)后肺部并發(fā)癥有關(guān)[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，開胸手術(shù)后有4%～15%的患者發(fā)生急性肺損傷[10]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，肺切除手術(shù)中使用正呼氣末壓（PEEP）或持續(xù)氣道正壓（CPAP）≥5 cmH2O，可顯著降低急性肺損傷的發(fā)病率[11]，因此如何減輕胸科手術(shù)引起的急性肺損傷是近年來研究的熱點。

NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，這些蛋白具有親同性相互作用的保守結(jié)構(gòu)域[12]，NLRP3炎性小體可與pyrin結(jié)構(gòu)域（PYD）之間的相互作用為ASC寡聚提供支架，參與炎癥的發(fā)生過程，發(fā)揮促炎作用[13]。ASC蛋白分子包含195個氨基酸殘基，是參與細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[14]。ASC作為細(xì)胞中一種重要的連接蛋白，通過Caspase-l活化途徑參與并在NLRP3炎性小體的組成中發(fā)揮重要作用[15]。Caspase-l可促進(jìn)GSDMD的裂解和易位，形成膜孔，促進(jìn)胞內(nèi)炎性物質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致焦亡。已有研究證實，導(dǎo)致ALI/ARDS的多種內(nèi)外源性因素可活化NLRP3炎癥小體，加重炎癥反應(yīng)[16]。因此本研究觀察肺組織GSDMD、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白含量的變化。

本研究結(jié)果顯示，使用右美托咪定可使肺病理學(xué)損傷評分降低、肺組織W/D值降低，OLV15、30、60 min及恢復(fù)雙肺通氣1 h OI升高，術(shù)后肺炎、肺不張的發(fā)生率降低，術(shù)后住院時間縮短表明右美托咪定可通過減輕肺水腫，改善雙肺通氣氧合，降低患者術(shù)后并發(fā)癥從而改善OLV肺損傷。此外本研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用右美托咪定肺組織 GSDMD、NLRP3、ASC和 Caspase-1表達(dá)下調(diào)，提示右美托咪定可抑制肺組織細(xì)胞焦亡，從而降低炎癥反應(yīng)，減輕肺葉切除術(shù)引起的急性肺損傷，其機(jī)制可能是右美托咪定通過激活中樞α2腎上腺受體抑制交感神經(jīng)活性，使體內(nèi)迷走神經(jīng)相對興奮，激活膽堿能抗炎途徑，與α7亞基的煙堿樣乙酰膽堿受體（α7nAChR）作用發(fā)揮抗炎作用，降低血漿中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）濃度[17-18]，同時顯著降低循環(huán)中兒茶酚胺的水平[19]；右美托咪定可阻止肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB 的核易位和轉(zhuǎn)錄降低 IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子濃度[20]，減輕 IL-6、IL-1β、TNF-α 等炎性因子對肺泡巨噬細(xì)胞的應(yīng)激，減少HMGB1的釋放和分泌，減弱炎癥級聯(lián)反應(yīng)[21]；其次，右美托咪定可能通過刺激α2腎上腺受體亞型增加酪氨酸磷酸化發(fā)揮其穩(wěn)定肺泡巨噬細(xì)胞和增加肺泡巨噬細(xì)胞可塑性的作用[22]，減少細(xì)胞破壞，從而減少HMGB1的釋放。HMGB1是人體內(nèi)非常重要的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，被鑒定為核非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，參與核小體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)。HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，然后被釋放到細(xì)胞外空間，在那里它作為一個典型的DAMP，通過與細(xì)胞受體結(jié)合來控制炎癥功能障礙包括Toll樣受體4（TLR-4）。TLR4是HMGB1的主要受體之一，經(jīng)過TLR4得到一系列的級聯(lián)，包括髓樣分化因子 88（MyD88），是在IRAKs激活后開始的。隨后IKK-α/IKK-β導(dǎo)致 IκB-α磷酸化和退化，最終導(dǎo)致激活NF-κB。有研究證實多氯聯(lián)苯29-pQ（PCB29-pQ）激活NLRP3炎性小體，介導(dǎo)Caspase-1活化，進(jìn)而促進(jìn)GSDMD的裂解和易位，形成膜孔，促進(jìn)胞內(nèi)炎性物質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[23]。有研究提示，HMGB1表達(dá)增加能夠正反饋調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體而加重急性肺損傷[24]。因此右美托咪定減少肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)HMGB1的釋放后降低肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體，NLRP3炎性小體抑制procaspase1為Caspase-1裂解，從而下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)GSDMD的表達(dá)從而抑制肺泡巨噬細(xì)胞焦亡，改善OLV引起的急性肺損傷。但是右美托咪定改善肺葉切除術(shù)由于OLV所引發(fā)的急性肺損傷發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜，目前尚不能完全預(yù)防，仍需多中心、大樣本探索其發(fā)病機(jī)制，為臨床預(yù)防提供依據(jù)。

綜上所述，本研究通過多中心、前瞻性、雙盲、隨機(jī)、對照研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可通過抑制肺泡巨噬細(xì)胞焦亡改善肺葉切除術(shù)患者肺組織炎癥反應(yīng)從而減輕急性肺損傷。