朱志鵬 凌曉燕 張才軍 周清河 周紅梅

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（endoplasmic reticulum stress，ERS）及細(xì)胞凋亡廣泛參與了心肌缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）的生理病理進(jìn)程，通過對相關(guān)ERS信號通路以及作用靶點(diǎn)的調(diào)控發(fā)揮心肌保護(hù)作用[1-3]，雖然人們通過細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)不斷探索可能的潛在機(jī)制，但目前具體作用機(jī)制仍不清楚。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）對重要臟器的IRI具有保護(hù)作用[4-6]，且對缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）性損傷的內(nèi)皮細(xì)胞[7]及非IRI引起ERS信號通路的分子伴侶、蛋白和細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出積極作用[8]。為進(jìn)一步明確DEX對心肌細(xì)胞損傷后ERS的影響及具體的信號通路，本研究通過構(gòu)建H9C2心肌細(xì)胞H/R模型，探討DEX對H/R下H9C2心肌細(xì)胞ERS的影響，并尋找可能的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2大鼠胚胎心肌細(xì)胞株由嘉興市第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，Annexin V/PI凋亡試劑盒 (上海索寶生物科技公司)，CCK-8試劑盒（日本東仁化學(xué)科技有限公司，CK-04），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose regulated protein 78，GRP78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP）、Caspase-12 特異性引物（上海索寶生物科技公司）。取出凍存的H9C2細(xì)胞，快速解凍，放入含有10%FBS和1%P/S的DMEM培養(yǎng)基（英國Gibco 公司，11995-065）中，以 1 000 r/min 離心 5 min，去上清液，細(xì)胞重懸，于37℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個培養(yǎng)皿底面積達(dá)到80%以上時，用0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，16000-004）消化，并按1∶3進(jìn)行傳代或進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將 DEX、4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）和p38絲裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）抑制劑（SB202190）均溶于二甲基亞砜（DMSO）溶液中，配置成各自目標(biāo)濃度為1 mmol/L、100 μmol/L和5 mmol/L的原始儲存液，分裝后低溫避光保存，短期使用前將其在水浴箱中迅速溶解，按1∶1 000比列加入培養(yǎng)基。

1.2 建立H/R實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證DEX的干預(yù)作用 參照前期研究，設(shè)立缺氧3 h復(fù)氧3 h的心肌缺血模型。將對數(shù)生長期H9C2細(xì)胞培養(yǎng)至密度為70%左右，制作單細(xì)胞懸液。按細(xì)胞密度為3×105個/ml接種于96孔板，過夜，每組3個復(fù)孔，設(shè)立對照板和H/R板（即Control組、DEX組、H/R組、DEX+H/R組、4-PBA組、4-PBA+H/R組、4-PBA+DEX+H/R組）。其中對照板正常培養(yǎng)基常氧條件下培養(yǎng)，與各實(shí)驗(yàn)組同一時間點(diǎn)換培養(yǎng)基；H/R板換無血清無糖的DMEM培養(yǎng)液后放入含5% CO2和95% N2密閉缺氧裝置（Billups-Rothenberg公司，MIC-101）中缺氧3 h，置換培養(yǎng)基常氧條件下培養(yǎng)3 h。DEX干預(yù)組（包括DEX組、DEX+H/R組和4-PBA+DEX+H/R組）在細(xì)胞貼壁后于H/R前1 h換溶解有1 μmol/L DEX的缺氧培養(yǎng)基，4-PBA干預(yù)組（包括4-PBA組、4-PBA+H/R組、4-PBA+DEX+H/R組）在H/R前的24 h加入培養(yǎng)基孵育，然后進(jìn)行缺氧3 h復(fù)氧3 h的實(shí)驗(yàn)程序。收集細(xì)胞上清液采用低損傷法檢測LDH濃度，CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，RT-PCR和 Western blot法檢測細(xì)胞 GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。

1.3 p38MAPK蛋白表達(dá)水平檢測 采用毒胡蘿卜素（TG組）體外孵育H9C2細(xì)胞10 h進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，DEX和4-PBA孵育同前。先將細(xì)胞分為對照（Control）組、H/R組和DEX+H/R組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束收集各組細(xì)胞，采用Western blot法，以 β-actin為內(nèi)參，檢測 p38MAPK（稀釋比 1∶1 000）和 p-p38MAPK（稀釋比 1∶1 000）目的蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達(dá)水平。再選擇SB202190進(jìn)行信號通路關(guān)鍵分子分析，將孵育好的細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、TG組、DEX+TG組、DEX+TG+4-PBA組、SB202190+TG組、DEX+TG+SB2020190組、DEX+TG+4-PBA+SB202190組。其中，4-PBA預(yù)處理24 h，TG預(yù)處理10 h，DEX預(yù)處理1 h及SB202190預(yù)處理10 min，然后正常培養(yǎng)至所需時間。收集細(xì)胞，分別檢測各組細(xì)胞活力、凋亡情況以及各組靶分子的基因和蛋白表達(dá)（檢測內(nèi)容與方法同1.2）。

1.4 細(xì)胞損傷檢測 按照CCK-8試劑盒說明，設(shè)置空白對照組和觀察組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，于96孔板中每孔加入10 μl CCK-8，約1 h后上機(jī)酶標(biāo)儀450 nm處測OD值，計(jì)算細(xì)胞活力（%）=（觀察-空白）/（對照-空白）（空白組為只加入了培養(yǎng)基的陰性對照）。同時，根據(jù)各組不同實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)LDH試劑盒要求，順序加入檢測試劑，酶標(biāo)儀450 nm處檢測OD值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH濃度。計(jì)算公式：細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH濃度=（測定OD值-對照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×N×1 000（N指稀釋倍數(shù)）。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞AnnexinV/PI雙染法，細(xì)胞以每孔2×105個鋪6孔板，按不同的實(shí)驗(yàn)分組方案要求分組培養(yǎng)，收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS清洗2遍，每管細(xì)胞樣品中加入500 μl Binding Buffer輕輕重懸細(xì)胞，加入 5 μl AnnexinV-FITC、5 μl Propidi Iodide，混勻，室溫避光孵育15 min。上機(jī)檢測，采用Sumol/lmit5.0軟件進(jìn)行分析。

1.6 RT-PCR檢測mRNA表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)各種處理后，棄上清液，PBS沖洗細(xì)胞，按照RNA提取試劑盒的操作步驟說明，以Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別取2 μl在PCR儀上配置25 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)，72℃最后延伸 10 min。引物分別為：GRP78 上游：5′ACTGGAATCCCTCCTGCTC-3′，下游：5′CAAACTTCTCGGCGTCAT 3′；CHOP 上游：5′TGCCTTTCGCCTTTGAGAC-3′，下游：5′GCTTTGGGAGGTGCTTGTG-3′；Capsase-12 上游：5′GGGATAGCCACTGCTGATA-3′，下游：5′GCCACTCTTGCCTACCTTC-3′。計(jì)算CT值，采用相對定量（relative quantities，RQ）＝2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算相對表達(dá)量。

1.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，其充分裂解，冷卻后離心取上清液，直接用于蛋白電泳上樣。采用BCA法計(jì)算檢測各組蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。分別以 CHOP（Affinity1∶1 000）、GRP78（Affinity1∶1 000）、Caspase-12（Affinity1∶1 000）一抗和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗反應(yīng)后，搖床上洗滌，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，配置顯影液，入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，拍照。通過 ImageProPlus軟件對發(fā)光條帶進(jìn)行定量分析。以β-actin為內(nèi)參，各蛋白的相對表達(dá)量=蛋白電泳條帶OD值/βactin產(chǎn)物電泳條帶OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件、GraphPad Prism5.0作圖軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet或Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2細(xì)胞活力、LDH濃度和細(xì)胞凋亡率的比較 與Control組相比，H/R組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），LDH 濃度明顯增加（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；與H/R組相比，DEX+H/R組與4-PBA+H/R組的細(xì)胞活力明顯增加，細(xì)胞上清液的LDH濃度降低，細(xì)胞凋亡率也降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組H9C2細(xì)胞活力、LDH濃度和細(xì)胞凋亡率的比較

2.2 各組細(xì)胞GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 與Control組相比，正常孵育下DEX組及4-PBA組在GRP78、CHOP和Caspase-12的mRNA和蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），而H/R組在3種基因和蛋白表達(dá)上分別一致上調(diào)（P＜0.05）。與H/R組相比，DEX+H/R組與4-PBA+H/R組在GRP78、CHOP和Caspase-12的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)（均P＜0.05）。與DEX+H/R組比較，DEX+H/R+4-PBA組的上述指標(biāo)進(jìn)一步反彈升高。見圖2。

圖1 各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后的流式細(xì)胞凋亡圖（H為缺氧，R為復(fù)氧，DEX為右美托咪定，4-PBA為4-苯基丁酸鈉鹽）

2.3 各組細(xì)胞p38MAPK及p-p38MAPK表達(dá)及細(xì)胞活力、LDH濃度、細(xì)胞凋亡情況的比較 與Control組比較，TG組H9C2細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），與 TG 組相比，DEX+TG 組 p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而各組間p38MAPK蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。與Control組比較，TG組細(xì)胞活力明顯下降，LDH濃度明顯增高；與TG組相比，DEX+TG組的細(xì)胞活力增高明顯，LDH濃度下降，細(xì)胞凋亡率明顯改善（P＜0.05）；與 DEX+TG 組比較，SB202190+TG組的細(xì)胞活力、LDH濃度和細(xì)胞凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均 P＞0.05），DEX+SB202190+TG組的各項(xiàng)指標(biāo)被p-p38MAPK抑制劑SB202190所逆轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)相反的方向變化（P＜0.05），見表 3。

2.4 各組細(xì)胞不同處理后GRP78、CHOP、Caspase-12和p38MAPK mRNA和蛋白表達(dá)的比較 DEX+TG組及SB202190+TG組之間的GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA和蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；與TG組相比，DEX+TG組、DEX+TG+4-PBA組、SB202190+TG 組、DEX+TG+SB2020190組、DEX+TG+4-PBA+SB202190 組的 GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA 和蛋白的表達(dá)均降低（均P＜0.05）；與DEX+TG組相比，DEX+TG+4-PBA 組、SB202190+TG 組、DEX+TG+SB2020190組、DEX+TG+4-PBA+SB202190組均能夠明顯增加GRP78、CHOP、Caspase-12 mRNA 和蛋白表達(dá)的上調(diào)（均P＜0.05），此外，DEX+TG+SB20219+4-PBA組的上調(diào)幅度最大。見圖3。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、Caspase-12表達(dá)的比較（a、b、c分別為 GRP78、CHOP、Caspase-12 的 mRNA 表達(dá)差異；d、e、f分別為 GRP78、CHOP、Caspase-12的蛋白表達(dá)差異。Con為Control組，1為DEX組，2為H/R組，3為DEX+H/R組，4為4-PBA組，5為4-PBA+H/R組，6為4-PBA+DEX+H/R組。與Con組比較，*P＜0.05；與 H/R 組比較，△P＜0.05；與 DEX+H/R 組比較，▲P＜0.05）

表2 DEX對TG誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞p38MAPK表達(dá)情況比較

表3 DEX對H/R條件下的不同處理組H9C2細(xì)胞活力、LDH濃度和細(xì)胞凋亡情況的比較

3 討論

心肌的缺血和再灌注損傷是臨床常見現(xiàn)象，雖然多方位防治策略的應(yīng)用在IRI基礎(chǔ)研究中獲得了成功，但是臨床應(yīng)用仍然難以改變患者結(jié)局及并發(fā)癥[9]。近年來動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10-12]，DEX可以減輕心肌IRI后的ERS，調(diào)控心肌凋亡程序，具有心肌保護(hù)作用。本研究一方面采用前期實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型，從心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡角度，研究DEX預(yù)處理對H9C2細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用，另一方面運(yùn)用TG誘導(dǎo)的H9C2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，探討DEX對ERS產(chǎn)生保護(hù)機(jī)制的可能機(jī)制。

DEX是一種高選擇性α2腎上腺素受體激動劑，近些年其器官保護(hù)作用吸引了大批學(xué)者的興趣。缺血再灌注研究方面，DEX顯示出具有一定的心肌保護(hù)[13]、肺保護(hù)[14]、中樞神經(jīng)保護(hù)[15]和腎臟保護(hù)[16]作用，另外，DEX還具有炎癥及相關(guān)信號通路調(diào)控[15，17]、細(xì)胞凋亡及自噬[18-19]等作用。ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是除了外源性凋亡途徑和死亡受體凋亡之外的又一途徑，是應(yīng)激感知和調(diào)控凋亡信號的主要機(jī)制[20]。細(xì)胞在缺血缺氧后，引起ERS導(dǎo)致GRP78的高表達(dá)，同時啟動未折疊蛋白反應(yīng)穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，主要通過ATF6、肌醇需酶和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）3條信號通路進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)ERS反應(yīng)失控以后，心肌細(xì)胞通過CHOP和Caspase-12信號通路的激活，而產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果證實(shí)右美托咪定可通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而保護(hù)其對于H/R時H9C2細(xì)胞的損傷，最終下調(diào)H/R損傷細(xì)胞的GRP78、CHOP、Caspase-12表達(dá)，而利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可以明顯逆轉(zhuǎn)DEX的保護(hù)效果，充分說明DEX是作用于ERS而發(fā)揮作用的。Peng等[21]利用原代乳鼠細(xì)胞H/R模型的研究顯示，DEX也能夠減輕心肌細(xì)胞H/R的損傷，只不過其實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)為缺氧1 h復(fù)氧24 h。GAO等[17]對缺氧1 h復(fù)氧12 h的H9C2細(xì)胞進(jìn)行DEX干預(yù)，發(fā)現(xiàn)1 μmol/L DEX能夠明顯減輕細(xì)胞損傷，與本實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)劑量及結(jié)果一致，但是模型參數(shù)不同，而且是通過白細(xì)胞介素的炎癥通路來調(diào)控?fù)p傷。至于兩者實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c本研究的差異，可能是來自于模型細(xì)胞的不同或目標(biāo)研究通路來自于非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

圖3 各組細(xì)胞不同處理下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）、Caspase-12 表達(dá)（a、b、c分別為 GRP78、CHOP、Caspase-12 的 mRNA 表達(dá)差異；d、e、f分別為 GRP78、CHOP、Caspase-12 的蛋白表達(dá)差異；g為GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白電泳圖。H為缺氧；R為復(fù)氧；DEX為右美托咪定；4-PBA為4-苯基丁酸鈉鹽；TG為毒胡蘿卜素；SB202190為p38MAPK特異性抑制劑。其中，Con代表Control組；1代表TG組；2代表DEX+TG組；3代表DEX+TG+4-PBA組；4代表SB202190+TG組；5代表DEX+TG+SB202190組；6代表DEX+TG+SB202190+4-PBA組。與Control組比較，*P＜0.05；與TG組比較，△P＜0.05；與 DEX+TG 組比較，▲P＜0.05）

p38MAPK是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的成員，它是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵，通過上游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化Thr-X-Tyr而被激活，在其眾多家族成員中，p38MAPK與感染、炎癥應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[22]。那么，p38MAPK是如何被激活的呢？首當(dāng)其沖的原因就是ERS。研究顯示，ASK1的自磷酸化可以導(dǎo)致MKK的活化和 p38MAPK 的激活[23]；Cardoso 等[24]研究指出，ERS可以激活多重信號通路，例如eIF2α、MAPK和NF-κB，從而引發(fā)下游級聯(lián)反應(yīng)，MAPK進(jìn)一步激活MAPK3/MAPK6，產(chǎn)生p-p38MAPK。除此之外，感染和其他原因引起的ERS也能夠誘導(dǎo)p38MAPK的激活[25]。本研究中TG誘導(dǎo)的ERS產(chǎn)生了與上述同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，p-p38 MAPK的表達(dá)明顯增加。

那么，在經(jīng)典的p38MAPK信號通路中，p-p38MAPK會導(dǎo)致什么下游變化呢？據(jù)報(bào)道，p-p38MAPK能夠?qū)е陆M織細(xì)胞 NF-κB 介導(dǎo)的炎癥[26-27]、自噬[28-29]和凋亡[30-31]等進(jìn)程。例如，雍陟等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注細(xì)胞中，p38MAPK通路明顯激活，結(jié)果導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡明顯增加，Sanit等[33]通過抑制p38MAPK信號通路，減輕缺血再灌注損傷。本研究中，筆者首次采用DEX預(yù)處理，得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生了p-p38 MAPK的高表達(dá)，通過激活p38MAPK信號通路，最終導(dǎo)致心肌凋亡的增加，而DEX預(yù)處理能夠抑制p38MAPK的激活，從而發(fā)揮類似于4-PBA的ERS凋亡保護(hù)作用。至于p38MAPK激活與下游凋亡信號通路的關(guān)系研究，不在本研究范圍之內(nèi)，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，H9C2細(xì)胞H/R時會導(dǎo)致異常的ERS和凋亡，伴隨p38MAPK信號通路的激活，DEX可通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)控p38MAPK以及下游凋亡信號通路，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。