施伎蟬 何貴清 寧洪葉 吳聯(lián)朋 吳正興 劉賽朵 葉新春 潘寧 蔣賢高

近年來，流動人口的增加、診治的延誤和不規(guī)范治療、患者依從性低等原因?qū)е履退幘甑脑黾樱斐赡投嗨幗Y(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）的流行[1]。2017年世界衛(wèi)生組織估算我國2016年新發(fā)病例89.5萬，耐多藥/單耐利福平（multidrug-resistant or rifampicin-resistant，MDR/RR）患者 5.8 萬[2]，而復治肺結(jié)核（re-treatment tuberculosis）中 MDR/RR-TB患者比例達到24%，遠高于初治肺結(jié)核（primary tuberculosis，TB）中MDR/RR-TB7.1%的比例，且復治肺結(jié)核治療成功后也有部分再次復發(fā)[3]。復治患者藥物暴露的時間越長，藥物治療的敏感性會越低[4]，并發(fā)其他疾病日益增多[5]，多種因素的影響導致復治肺結(jié)核的治愈率僅有60%左右[6]。因此快速檢測復治肺結(jié)核患者的耐藥性、及時準確提供有效的治療，對結(jié)核病疫情的控制均至關重要。本研究以BACTEC MGIT 960耐藥性檢測結(jié)果為金指標，將161例復治肺結(jié)核患者感染菌株分別進行結(jié)核分枝桿菌（MTB）耐藥基因芯片檢測及BACTEC MGIT 960耐藥性檢測，將結(jié)果進行比對分析，旨在探討耐藥基因芯片檢測技術在復治肺結(jié)核患者中的臨床應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 收集本院2017年1月至2018年12月門診和住院復治肺結(jié)核患者161例，男102例，女59例，年齡29～68（49.0±18.5）歲。復治肺結(jié)核的診斷標準參照《WS 196-2017結(jié)核病分類》衛(wèi)生行業(yè)標準[7]，有下列情況之一者為復治：（1）因結(jié)核病不合理或不規(guī)則服用抗結(jié)核藥物治療≥1個月的患者；（2）初治失敗或復發(fā)的患者。同時經(jīng)菌型鑒定排除非結(jié)核分枝桿菌3例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理批準，所有患者已簽署知情同意。

1.2 標本采集 161例患者各留取痰標本各2份，門診患者留取即時痰（就診當時咳出的痰），住院患者留取清晨痰（起床后深咳吐出的痰）。均分別送檢BACTEC MGIT 960系統(tǒng)結(jié)核菌液體培養(yǎng)+藥敏試驗、MTB耐藥基因芯片檢測。質(zhì)控菌株為H37Rv（ATCC27294）標準株，由國家結(jié)核參比實驗室提供。

1.3 試劑與儀器 MTB耐藥基因芯片試劑盒由亞能生物技術有限公司提供；朗基L96+/Y型PCR儀/基因擴增儀，購自杭州朗基科學儀器有限公司；羅氏診斷realtime PCR 擴增儀（型號：LC-480I和 Z480）、FYY-3型分子雜交儀均購自深圳亞能生物技術有限公司；Fosun生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司；美國BD公司BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀及其配套試劑。

1.4 MTB耐藥基因芯片檢驗方法及結(jié)果判讀

1.4.1 細菌培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗 所有痰標本按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[8]進行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗[利福平（RFP）、異煙肼（INH）、鏈霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）的耐藥性]。

1.4.2 DNA提取 痰標本1 ml加等量4%NaOH液化后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，混勻；離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，棄上清液。向沉淀中加入50 ml細胞裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，留上清液進行PCR。

1.4.3 膜芯片設計 經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫檢索和比對分析，設計23條特異性探針，并點樣至尼龍膜上，制成膜芯片。

1.4.4 PCR擴增 取出PCR反應管，在管壁上做好標記，離心半徑8 cm，50 000 r/min離心2 min，加入已提取的待測樣品 DNA 4 μl。同時取兩管PCR反應管分別加入陽性標本提取的DNA和陰性標本提取的DNA，作為產(chǎn)品使用過程的質(zhì)量控制。反應體系如下：模板 DNA 20 ng、2.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μl，DNA Taq 酶2.5 U，10×PCR 緩沖液 2.5 μl。使用 ABI-7300 儀器擴增，循環(huán)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 45 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數(shù)為30；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、68 ℃60 s，循環(huán)次數(shù)為 30；68 ℃ 5 min。

1.4.5 反向斑點雜交技術 取檢測膜條置15 ml離心管中，加5 ml雜交緩沖液（1×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基硫酸鈉）和PCR產(chǎn)物，沸水浴10 min，58℃雜交2 h。將膜條移至裝有預熱洗液（0.5×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基鈉）的50 ml管中，于58℃輕搖洗滌15 min。用雜交緩沖液配制 1∶2 000的過氧化物酶溶液，室溫輕搖泡膜30 min，棄過氧化物酶液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗膜2次，5 min/次。將膜條浸泡于新鮮配制的顯色液中（0.1 mol/L檸檬酸鈉19 ml、2 mg/ml四甲基聯(lián)苯胺 1 ml、3% H2O210 μl），避光顯色 5～10 min，出現(xiàn)藍色斑點即為含有相應的待檢基因。

1.4.6 結(jié)果判讀 陽性質(zhì)控品正常顯色而臨床樣本只有第CC位點顯色，表明被檢樣本為陰性（即無MTB）或者樣本中待檢測的MTB在本試劑盒最低檢出限以下。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，兩種方法檢測結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗判讀，Kappa 0.81～1幾乎完全一致，Kappa0.61～0.80高度一致性，Kappa 0.41～0.60 中等一致性，Kappa0.21～0.40 一般一致性，Kappa0.0～0.20極低一致性[9]。采用χ2檢驗比較基因芯片法和傳統(tǒng)比例法檢測結(jié)果的差異。計算靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因芯片檢測與 BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果 161份痰標本中，耐藥基因芯片檢測共檢出MTB基因陽性122份，陽性檢出率為75.78%（122/161），其中野生型58份，突變型64份，耐藥基因突變菌株占陽性菌株的52.50%（64/122）。在122例耐藥基因芯片陽性患者中，同時BACTEC MGIT 960培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性104例。對這104例患者的標本進行分析：基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測同時提示耐藥為54例，同時提示敏感為38例，基因芯片提示耐藥而BACTEC MGIT 960藥敏檢測敏感為5例，基因芯片提示敏感而BACTEC MGIT 960藥敏檢測耐藥為7例，兩種方法一致率為88.46%（92/104），靈敏度為88.52%（54/61），特異度為 88.37%（38/43），陽性預測值和陰性預測值分別為 91.52%（54/59）和 84.44%（38/45）。經(jīng) χ2檢驗，兩種方法對檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=60.75，P＜0.001），Kappa值為 0.764，兩種方法有高度的一致性。

2.2 耐藥基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏試驗對RFP的耐藥性檢測結(jié)果 對RFP的耐藥性檢測，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測同時提示RFP耐藥為42例，同時提示RFP敏感為46例，耐藥基因芯片提示RFP耐藥而BACTEC MGIT 960藥敏檢測RFP敏感為1例，耐藥基因芯片提示RFP敏感而BACTEC MGIT 960藥敏檢測RFP耐藥為15例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果對RFP一致率為84.62%（88/104），靈敏度為73.68%（42/57），特異度為97.87（46/47），陽性預測值和陰性預測值分別為 97.67%（42/43）和 75.41%（46/61）。經(jīng) χ2檢驗，兩種方法對檢測RFP耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=55.80，P＜0.001），Kappa 值為 0.713，兩種方法有高度的一致性。

2.3 耐藥基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏試驗對INH的耐藥性檢測結(jié)果 對INH的耐藥性檢測，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測同時提示INH耐藥為42例，同時提示INH敏感為46例，耐藥基因芯片提示INH耐藥而BACTEC MGIT 960藥敏檢測INH敏感為5例，耐藥基因芯片提示INH敏感而BACTEC MGIT 960藥敏檢測INH耐藥為11例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果對INH一致率為84.62%（88/104），靈敏度為79.25%（42/53），特異度為90.20%（46/51），陽性預測值和陰性預測值分別為 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57）。經(jīng) χ2檢驗，兩種方法對檢測INH耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=50.60，P＜0.001），Kappa 值為 0.693，兩種方法有高度的一致性。

2.4 耐藥基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏試驗對SM的耐藥性檢測結(jié)果 對SM的耐藥性檢測，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測同時提示SM耐藥為28例，同時提示SM敏感為62例，耐藥基因芯片提示SM耐藥而BACTEC MGIT 960藥敏檢測SM敏感為6例，耐藥基因芯片提示SM敏感而BACTEC MGIT 960藥敏檢測SM耐藥為8例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果對SM一致率為86.54%（90/104），靈敏度為 77.78%（28/36），特異度為91.18%（62/68），陽性預測值和陰性預測值分別為82.35%（28/34）和 88.57%（62/70）。經(jīng) χ2檢驗，兩種方法對檢測SM耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=50.86，P＜0.001），Kappa值為0.699，兩種方法有高度的一致性。

2.5 耐藥基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏檢測對EMB的耐藥性檢測結(jié)果 對EMB的耐藥性檢測，耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960藥敏檢測同時提示EMB耐藥為12例，同時提示EMB敏感為77例，耐藥基因芯片提示EMB耐藥而BACTEC MGIT 960藥敏檢測EMB敏感為3例，耐藥基因芯片提示EMB敏感而BACTEC MGIT 960藥敏檢測EMB耐藥為12例，耐藥基因芯片結(jié)果與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果對EMB一致率為85.57%（89/104），靈敏度為50.00%（12/24），特異度為96.25%（77/80），陽性預測值和陰性預測值分別為 80.00%（12/15）和 86.52%（77/89）。經(jīng) χ2檢驗，兩種方法對檢測EMB耐藥率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=47.78，P＜0.001），Kappa值為 0.677，兩種方法有高度的一致性。

2.6 MTB耐藥基因芯片檢測結(jié)果 對這104份標本進行分析，其中59株耐藥基因突變的菌株，rpoB基因突變占 72.88%（43/59），katG+inhA基因突變占 79.66%（47/59），rpsL基因突變占 57.63%（34/59），embB 基因突變占25.42%（15/59），多重耐藥菌株占耐藥菌株的74.57%（44/59）。不同突變類型各個突變基因位點的檢出情況見表1。

表1 不同突變基因在59株耐藥菌株中的檢出情況

3 討論

復治患者是耐藥肺結(jié)核的高發(fā)人群，馬艷等[10]對全國22家醫(yī)療機構(gòu)377例確診的復治肺結(jié)核患者調(diào)查問卷顯示耐藥率為39.26%，而溫州地區(qū)老年復治患者總耐藥率高達52.27%[11]，因此，復治肺結(jié)核患者快速準確的耐藥性檢測[12]及指導臨床用藥以提高結(jié)核病治療療效，防止耐藥MTB的產(chǎn)生和傳播具有重要意義。由于MTB生長速度慢，傳統(tǒng)的藥敏試驗周期較長，需4～8周才出結(jié)果，不能為臨床提供時效性檢測結(jié)果[13]，不僅影響患者的早期診斷和治療，而且還加速了耐多藥結(jié)核病的傳播[14]。PCR熒光探針技術在快速診斷結(jié)核病中具有一定的的臨床價值[15]，但無法檢測耐藥性。GeneXpert Mtb/RIF系統(tǒng)雖然檢測MTB的靈敏度和特異度高，但僅能檢測RFP rpoB基因是否發(fā)生耐藥[16]，而且所需設備及試劑價格昂貴，維護成本較高，難以在基層單位廣泛開展。而耐藥基因芯片法檢測不僅能同時檢測RPF、INH、SM、EMB是否發(fā)生耐藥，檢測時間僅需1 d，更實用于檢測復治肺結(jié)核所感染菌株的耐藥性。

臨床上常用的一線抗結(jié)核藥RPF、INH、SM、EMB均可產(chǎn)生耐藥。MTB耐藥基因芯片檢測系統(tǒng)根據(jù)與結(jié)核菌耐藥性高度相關的5種不同耐藥基因的突變位點來設計特異擴增引物，根據(jù)不同耐藥基因的相應突變位點設計相應特異探針，將高敏感度的PCR技術和高通量的反向斑點雜交技術相結(jié)合的基因檢測技術，可同時對導致上述4種抗結(jié)核藥耐受的絕大多數(shù)的突變類型進行檢測，具有快速、準確、特異、高通量的特點，成為近年來研究的熱點。

本研究結(jié)果顯示：在122例耐藥基因芯片陽性患者中，同時BACTEC MGIT 960培養(yǎng)MTB陽性僅104例，考慮與臨床送檢標本質(zhì)量有關，同時需排除死菌可能。BACTEC MGIT 960藥敏檢測基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果一致率為88.46%（92/104），對RPF、INH、SM、EMB耐藥性檢測的一致率分別為84.62%（88/104）、84.62%（88/104）、86.54%（90/104） 和 85.57%（89/104），與白雪娟等[17]結(jié)果一致，略低于林明冠等[18]報道，考慮原因：一方面與本研究是直接檢測痰標本中的MTB-DNA，而林明冠是檢測MTB分離株的DNA有關；另一方面與臨床標本中結(jié)核分枝桿菌存在異質(zhì)性耐藥有關[19]。耐藥基因芯片檢測與BACTEC MGIT 960藥敏檢測結(jié)果相比，Kappa值均在0.61～0.80，提示MTB耐藥基因芯片與BACTEC MGIT 960兩種檢測法具有高度的一致性，對RPF、INH、SM、EM的耐藥性檢測同樣保持高度一致。與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，基因芯片技術檢測對RFP耐藥的靈敏度為73.68%（42/57），特異度為97.87（46/47），陽性預測值和陰性預測值分別為97.67%（42/43）和75.41%（46/61）。對INH耐藥靈敏度為79.25%（42/53），特異度為90.20%（46/51），陽性預測值和陰性預測值分別為 89.36%（42/46）和 80.70%（46/57），與張瑞梅等[20]研究結(jié)果相似。表明基因芯片技術在臨床實際中有較好的應用價值。

本研究采用MTB耐藥基因芯片檢測系統(tǒng)進行rpoB、katG、inhA、rpsL、embB 基因突變檢測，122份耐藥基因芯片陽性標本中，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性104份，其中59株發(fā)生耐藥基因突變。國內(nèi)外大量的研究數(shù)據(jù)均證明RFP的耐藥性95%左右是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，突變均發(fā)生在rpoB 507～533位的氨基酸組成的區(qū)域內(nèi)[21-22]。INH的耐藥性50%～70%是由編碼過氧化氫酶-過氧化物酶的katG基因的315位點突變引起的，5%～10%是由烯?；€原酶編碼基因inhA的突變引起的[23]。EMB的耐藥性是由編碼糖基轉(zhuǎn)移酶（催化阿拉伯糖聚合到阿拉伯-半乳聚糖）的embB基因的306位點突變引起[24]，SM的耐藥性是由編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因突變引起[25]，多發(fā)生在43位和88位氨基酸上。本研究結(jié)果顯示rpoB基因突變占72.88%（43/59），其中531位點突變發(fā)生率最高為47.46%（28/59），與李麗等[26]研究結(jié)果一致。katG+inhA基因突變占79.66%（47/59），其中katG315位密碼子突變 66.1%（39/59），inhA-15位突變13.56%（8/59）。rpsL 基因突變占 57.63%（34/59），embB基因突變占25.42%（15/59），其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的74.57%（44/59），說明溫州地區(qū)復治肺結(jié)核患者一線抗結(jié)核藥物的耐藥率高。

綜上所述，目前溫州地區(qū)復治肺結(jié)核耐藥形式嚴峻，尤其耐多藥結(jié)核面臨嚴重挑戰(zhàn)[27]。MTB耐藥基因芯片檢測系統(tǒng)能夠快速的進行結(jié)核分枝桿菌診斷檢測及一線結(jié)核藥物耐藥性監(jiān)測，且與BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及藥敏試驗保持高度一致，可成為篩查結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速有效的方法，為臨床提供準確、及時、有效的實驗室檢查依據(jù)，使患者及時得到有效的治療，避免繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生，節(jié)省醫(yī)療成本，控制傳播和預后，對復治肺結(jié)核患者具有很好的臨床應用價值。